АНАЛИЗ СТАБИЛЬНОСТИ РЕКОМБИНАНТНОГО ОНКОГЕНА РАСТЕНИЙ ROLA ПРИ ДОЛГОВРЕМЕННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ RUBIA CORDIFOLIA L.

АНАЛИЗ СТАБИЛЬНОСТИ РЕКОМБИНАНТНОГО ОНКОГЕНА РАСТЕНИЙ ROLA ПРИ ДОЛГОВРЕМЕННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ RUBIA CORDIFOLIA L.

Соломатина Таисия Олеговна

студент, Дальневосточный Федеральный Университет,

РФ, г. Владивосток

Махазен Дмитрий Сергеевич

науч. сотр., Федеральный научный центр Биоразнообразия,

РФ, г. Владивосток

ANALYSIS OF THE STABILITY OF ROLA PLANTS RECOMBINANT ONCOGEN DURING LONG-TERM CULTIVATION OF RUBIA CORDIFOLIA L. CELL CULTURE

Taisia Solomatina

Student, Far Eastern Federal University,

Russia, Vladivostok

Dmitrii Makhazen

Researcher, FSC Biodiversity,

Russia, Vladivostok

АННОТАЦИЯ

Вторичные метаболиты растений, фитоалексины, синтезируются клетками растений в ответ на негативные воздействия и широко используются в медицине. Для редких видов лекарственных растений, а так же для комплексных фитоалексинов альтернативным источником получения являются клеточные культуры. Наиболее интересным в прикладном плане является эффект активации биосинтеза вторичных метаболитов геном rolA. Ранее было показано, что после более чем 20 лет культивирования трансгенной клеточной культуры лекарственного растения марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.) произошла спонтанная активация биосинтеза антрахинонов, что не характерно для клеточных культур растений. Обнаружение причины спонтанной и стабильной активации биосинтеза вторичных метаболитов позволит использовать данный подход для получения высокопродуктивных культур других растений. Представленная работа направлена на исследование изменения одного из растительных онкогенов rol – гена rolA при долговременном культивировании. Для ответа на поставленные вопросы был применен широкий спектр современных методов биотехнологии и молекулярной биологии.

ABSTRACT

Secondary plant metabolites, phytoalexins, are synthesized by plant cells in response to negative influences and are widely used in medicine. For rare species of medicinal plants, as well as for complex phytoalexins, cell cultures are an alternative source of production. The most interesting from the applied point of view is the effect of activation of the biosynthesis of secondary metabolites by the rolA gene. Earlier it was shown that after more than 20 years of cultivation of a transgenic cell culture of the medicinal plant Rubia cordifolia L., spontaneous activation of anthraquinones biosynthesis occurred, which is not typical for plant cell cultures. Finding the reason for the spontaneous and stable activation of the biosynthesis of secondary metabolites will make it possible to use this approach to obtain highly productive crops of other plants. The presented work is aimed at studying the change in one of the plant rol oncogenes, the rolA gene, during long-term cultivation. To answer the questions posed, a wide range of modern methods of biotechnology and molecular biology were applied.

Ключевые слова: клеточные культуры растений, Rubia cordifolia L., агробактериальные онкогены, антрахиноны.

Keywords: plant cell cultures, agrobacterial oncogenes, anthraquinones.

Введение. Вторичные метаболиты растений, фитоалексины, соединения различной природы, которые синтезируются клетками растений в ответ на негативные воздействия. Фитоалексины являются основным средством защиты растений при атаке разнообразных патогенов. Соединения растительного происхождения нашли свое место в медицине и широко используются, в настоящее время главным образом в виде синтетических аналогов [1]. При этом полный спектр свойств некоторых соединений более выражен при биосинтезе в клетке. Для редких видов лекарственных растений (например, женьшень), а так же для комплексных фитоалексинов (например, циннамилгликозиды родиолы розовой) альтернативным источником получения являются клеточные культуры. Поэтому актуальным направлением в области метаболической инженерии растительной клетки является поиск эффективного и универсального эффектора [2].

Наиболее интересным в прикладном плане является эффект активации биосинтеза вторичных метаболитов геном rolA. За почти 20 лет непрерывной культивации трансгенная клеточная культура R. Cordifolia не утратила своих свойств, а напротив – биосинтез антрахинонов увеличился более чем в 10 раз [3]. Произошла активация вторичного метаболизма без нарушения роста культуры, эффектор сохраняется годами, что даёт перспективу создания суперпродуцента вторичных метаболитов марены сердцелистной из трансформированной клеточной культуры (Рисунок 1). И обнаружение причины спонтанной и стабильной активации биосинтеза вторичных метаболитов позволит использовать данный подход для получения высокопродуктивных культур других растений.

Рисунок 1. Фенотип клеточных культур марены, культивируемых с 2008 по 2018 гг. Нормальная культура (R) и трансформированная линия rolB (RB) были использованы для сравнения количества и состава антрахинонов с линией RA при длительном культивировании

Фундаментальные исследования данного гена, а именно его молекулярных механизмов не привели к полной картине понимания его работы, некоторые работы имели полностью противоположные результаты. Единственная попытка компьютерного моделирования структуры белка RolA была проведена в работе [4]. В данной работе было применено несколько доступных на тот момент алгоритмов для компьютерного моделирования белка. Авторы пришли к наиболее, по их мнению, подходящей сравнительной модели RolA основанной на структуре домена папиломовируса E2 (2bopA). В рамках данной модели было предположено, что RolA является белком способным связывать ДНК, транскрипционным фактором (ТФ). Было отмечено несколько аминокислот, которые предположительно связываются с ДНК: D0, D7, B12, B17, S23, K24, R27, R28, K32, R33, R43, N51, S80. Так же было сделано предположение, что RolA является димерным белком. Однако прояснить сайт связывания авторам не удалось, так как домен папиломовируса (bovine papillomavirus-1 E2 DNA-bindingdomain) – узнает палиндром ACCGNNNNCGGT, который не встречается в растении, а предположить сайт связывания основываясь только на модели проблематично. Несколько мутаций, найденных в онкогене, совпадают с аминокислотами важными для связывания с ДНК: R43C, N51S. Весьма вероятно, что данные мутации могут повлиять на транскрипционную активность белка.

Представленная работа направлена на исследование изменения одного из растительных онкогенов rol – гена rolA при долговременном культивировании трансгенной клеточной культуры марены сердцелистной. Одной из наиболее вероятных причин может быть накопление и закрепление в трансгене мутаций, которые спровоцировали изменение функциональной нагрузки белка RolA.

Материалы и методы. В качестве объекта исследования использовали нетрансформированные и трансформированные геном rolA каллусные культуры марены сердцелистной (R. cordifolia L.). Контрольная (нетрансформированная) культура и трансгенная культура марены сердцелистной были получены из листьев растений марены сердцелистной, собранных в Анученском районе Приморского края [5].

Для культивирования и проведения экспериментов использовали питательные среды, содержащие макросоли «W» по прописи Уайта [6] и микросоли «MS» по прописи Мурасиге и Скуга [7]. В среду добавляли 0.5 мг/л 6-бензиламинопурина и 2 мг/л 2-нафтилуксусной кислоты в качестве регуляторов роста. Для культивирования каллусных культур в среду дополнительно вносили агар – 6 г/л. рН среды доводили до значения 5.6 - 5.8 при помощи 5%-ного раствора КОН. Питательные среды стерилизовали автоклавированием при температуре 120°С и давлении от 0,8 до 1,0 атмосфер в течение 20 минут.

ДНК из свежей и высушенной ткани клеточных культур выделяли методом ДСН буфера. Качество ДНК оценивали при помощи гель-электрофореза в 0,8 % агарозном геле в присутствии бромистого этидия (0,2 мкг/мл). Анализ мутаций в трансгене проводили на основе ПЦР продуктов, полученных на матрице ДНК, выделенной из трансформированных культур, со специфическими праймерами к 5’- и 3’- нетранслируемым регионам гена rolA. Дизайн праймеров осуществляли в программе GeneRunner 3.0 с учетом оптимальных условий проведения амплификации. Праймеры к гену rolA: прямой 5'- ATCATTGCGTAGACTGCATATTG -3' и обратный 5'- CGAAGACCGCCAGCCACGTG -3' фланкировали фрагмент 566 п.н.

Для клонирования продукты ПЦР очищали от компонентов смеси, димеров праймеров или неспецифических продуктов амплификации выделением из легкоплавкого геля (Sigma, USA) при помощи стандартной экстракции с фенолом [8]. Очищенные ПЦР продукты клонировали в pJET вектор с использованием набора для клонирования CloneJET PCR CloningKit (ThermoFisher, США) согласно протоколу производителя. Полученной лигазной смесью трансформировали E. coli, штамм Turbo (NewEnglandBioLab, США). Проводили трансформацию с применением хлористого кальция. Полученные на следующий день колонии анализировали ПЦР, полученные ПЦР продукты анализировали в агарозном геле, отбирали фрагменты, ожидаемого размера с парой праймеров: M13(-20) 5’-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3’ и M13(-26) 5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’. Реакцию секвенирования проводили с использованием набора BigDyeTerminatorCycleSequencingKit (Perking-ElmerBiosystems, CA) в амплификаторе iCycler, программированном на следующие условия реакции: предварительная денатурация 96 °С – 1 минуту, затем 30 циклов, включавших 96 °С – 20 секунд, 55 °С – 20 секунд, 60 °С – 3 минуты. После осаждения этанолом последовательность была определена на секвенаторе ABI 310 GeneticAnalyser (AppliedBiosystems).

Поиск гомологов секвенированных фрагментов ДНК осуществляли в базе данных последовательностей GenBank в программе BLAST. Аминокислотные последовательности, соответствующие секвенированным фрагментам кДНК, определяли в программе GeneRunner 3.0.

Результаты и обсуждение. В результате ПЦР со специфическими праймерами, фланкирующими полностью 5’UTR, кодирующую часть и часть 3’UTR гена rolA (Рисунок 2, А), были получены ампликоны ожидаемого размера на матрице ДНК, выделенной из сухой и свежей ткани культуры RA, при этом на матрице ДНК контрольной культуры ампликонов не было (Рисунок 2, Б).

Рисунок 2. Схематическое изображение расположения олигонуклеотидов для ПЦР (а) относительно структуры гена rolA (720 п.н.), темно-серый блок соответствует кодирующей части гена rolA, CDS; светло-серые блоки соответствуют 5’- и 3’- нетранслируемым регионам (5’- и 3’ UTR), D-primer и R-primer соответствуют расположению прямого и обратного праймеров, фланкирующих фрагмент размером 566 п.н. Электрофореграмма (б) продуктов ПЦР с описанными выше праймерами на матрицах ДНК, выделенной из сухой (‘08) и свежей (‘20) ткани клеточных культур R (нетрансгенный контроль) и RA (rolA-трансгенная культура); Pc – позитивный контроль, где в качестве матрицы использована плазмида E3, содержащая полноразмерную последовательность нативного гена rolA; Nc1 и Nc2 – отрицательные контроли, без добавления какой-либо матрицы и без добавления праймеров, соответственно; M – маркер молекулярных весов ДНК, 10000-150 п.н., СибЭнзим. Электрофорез проведен в 0,8 % агарозном геле в присутствии 0,2 % этидиума бромида

Было проанализировано по 30 клонов с матриц ДНК RA культур 2008 г. и 2020 г. Из 30 клонов 2008 г не было обнаружено ни одной мутации. При этом, из 30 клонов с ДНК 2020 г. было обнаружено 3 клона с мутациями в 5’-НТР  и 3 мутанта в кодирующей части (Рисунок 3).

Рисунок 3. Схематическое изображение обнаруженных мутаций гена rolA на матрице ДНК клеточной культуры R. Cordifolia, трансформированной агробактериальным онкогеном rolA, после 20 лет культивирования. Rol-CDS, кодирующая часть гена rolA; 5’UTR и 3’UTR, 5’- и 3’- нетранслируемые области, соответственно. гена rolA. RolA-WT, нативная форма гена rolA; rolA-MU1-3, формы гена, имеющие мутации в 5'-нетранслируемой области (5'UTR); rolA-MC, формы гена, имеющие мутации в кодирующей части последовательности (CDS). В правой части рисунка приведены фрагменты последовательностей, содержащие исследуемые нуклеотидные замены

Также был проведен биоинформатический анализ белка RolA. На данный момент функция, локализация и трехмерная структура белка RolA недостаточно изучена. Для анализа функции in silico было поведено сравнительное моделирование и построение возможной модели. В программном комплексе SWISS-MODEL входящем в состав EXPASY (SwissBioinformaticResourcePortal) было проведено сравнительное моделирование белка RolA. Поиск шаблона показал несколько моделей доступных для моделирования белка (Таблица 1).

Таблица 1.

Результаты поиска шаблонов для моделирования белка RolA

В таблице 1 представлены результаты поиска. Из неё можно сделать вывод, самая распространенная модель для сравнения – белок TrfBtranscriptionalrepressorprotein. Данный белок является транскрипционным фактором, димером. На основе модели 5cm3.1 (Рисунок 4, A) была создана 3D модель белка RolA (Рисунок 4, В).

Рисунок 4. 3D модели структур. A - Структура модели 5cm3.1 B –смоделированная структура онкогена RolA на основе модели 5cm3.1

Для дальнейшего сравнительного моделирования и поиска гомологов был использован программный комплекс HHpred [9]. Результаты анализа частично повторяли результаты EXPASY, но среди гомологов также был обнаружен белок Middleoperonregulator (1RR7_A), который обладает транскрипционной активностью. Анализ de novo был проведен в программе RaptorX [10] для определения 3D структур. Анализ показал возможную структуру, представляющую характерный для многих транскрипционных факторов паттерн – Спираль-Петля-Спираль.

Представляет интерес для изучения влияния каждой мутации на функции белка, однако на данном этапе представляется возможным только оценить вклад мутаций в стабильность белка методами in silico. Это было сделано в программе PROVEAN [11]. В результате проверки, каждая мутация приводила к пониженной стабильности белка RolA.

Исходя из этой серии анализов можно предположить репрессионную транскрипционную функцию у белка RolA, а также то, что найденные мутации вероятно могут влиять на её активность, понижая стабильность самого белка и, таким образом, нивелируя его репрессионное действие.

Список литературы:

1. Croft SL. From natural products to drugs. Curr. Opin. Infect. Dis., 2001, 14, 717-718.
2. Sepúlvelda-Boza, S.; Cassels, B.K. Plant Metabolites Active against Trypanosoma cruzi. Planta Med., 1996, 62, 98-105.
3. Veremeichik G.N. Activation of anthraquinone biosynthesis in long-cultured callus culture of Rubia cordifolia transformed with the rolA plant oncogene/ G.N. Veremeichik, V.P. Bulgakov, Y.N. Shkryl, S.A. Silantieva, D.S. Makhazen, G.K. Tchernoded, N.P. Mischenko, S.A. Fedoreyev, E.A. Vasileva // Journal of Biotechnology. –2019. – V. 306. P. 38–46.
4. Rigden D. J., Carneiro M. A structural model for the rolA protein and its interaction with DNA //Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. – 1999. – Т. 37. – №. 4. – С. 697-708.
5. Bulgakov V.P., Tchernoded G.K., Mischenko N.P., Khodakovskaya M.V., Glazunov V.P., Zvereva E.V., Fedoreyev S.A., Zhuravlev Y.N. Effect of salicylic acid, methyl jasmonate, ethephon and cantharidin on anthraquinone production by Rubia cordifolia callus cultures transformed with the rolB and rolC genes // J. Biotechnol. 2002. Vol. 97. P. 213-221.
6. White P. The cultivation of animal and plant cells. NY.: Ronald Press. 1963.
7. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15. P. 473-497.
8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж.Молекулярноеклонирование. М.: Мир, 1984.
9. Zimmermann L. et al. A completely reimplemented MPI bioinformatics toolkit with a new HHpred server at its core //Journal of molecular biology. – 2018. – Т. 430. – №. 15. – С. 2237-2243.
10. Källberg M. et al. Template-based protein structure modeling using the RaptorX web server //Nature protocols. – 2012. – Т. 7. – №. 8. – С. 1511-1522.
11. Choi Y. et al. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels //PloS one. – 2012. – Т. 7. – №. 10. – С. e46688.Artimo P. et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal //Nucleic acids research. – 2012. – Т. 40. – №. W1. – С. W597-W603.