ВЛИЯНИЕ ПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ НА ДИМАМИКУ ЛЕКТИНОВОЙ АКТИВНОСТИ ПРОРОСТКОВ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ

ВЛИЯНИЕ ПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ НА ДИМАМИКУ ЛЕКТИНОВОЙ АКТИВНОСТИ ПРОРОСТКОВ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ

Ляшенко Мария Алексеевна

аспирант, Казанский (Приволжский) Федеральный Университет,

РФ, г. Казань

Тимофеева Ольга Арнольдовна

проф., канд. биол. наук, Казанский (Приволжский) Федеральный Университет,

РФ, г. Казань

INFLUENCE OF PATHOGENIC FUNGI ON THE DYMAMICS OF LECTIN ACTIVITY IN SPRING WHEAT SPROUTS

Maria Lyashenko

Postgraduate student, Kazansky (Volga region) Federal University,

Russia, Kazan

Olga Timofeeva

Professor, Cand. biol. sciences, Kazan (Volga) Federal University,

Russia, Kazan

АННОТАЦИЯ

Статья посвящена изучению лектиновой активности у проростков яровой пшеницы (Triticum aestivum  L.) сорта Омская-33 при инфицировании фитопатогенными грибами Fusarium oxysporum и Aspergillus niger. Известно, что лектины играют важную роль в защите растений от неблагоприятных биотических и абиотических факторов окружающей среды.  В работе были выявлены, изменения активности растворимых и лектинов клеточной стенки в течении четырех суток после инфицирования фитопатогенными грибами. Обнаруженная динамика активности лектинов пшеницы может свидетельствовать о различной чувствительности и специфичности гриба к растению хозяина.

ABSTRACT

The article is devoted to the study of lectin activity in seedlings of spring wheat (Triticum aestivum L.) variety Omskaya-33 when infected with phytopathogenic fungi Fusarium oxysporum and Aspergillus niger. It is known that lectins play an important role in protecting plants from unfavorable biotic and abiotic environmental factors. The work revealed changes in the activity of soluble and lectins of the cell wall within four days after infection with phytopathogenic fungi. The observed dynamics of the activity of wheat lectins may indicate different sensitivity and specificity of the fungus to the host plant.

Ключевые слова: лектины, фитопатогены, активность, Fusarium oxysporum, Aspergillus niger

Keywords: lectins, phytopathogens, activity, Fusarium oxysporum, Aspergillus niger.

Основной причиной ухудшения состояния посевов озимой пшеницы является большое количество неперегнивших пожнивных остатков и утомлённость почв. На остатках соломы и стерни сохраняются возбудители грибных болезней, заражающие спорами растения пшеницы ранней весной. В верхнем почвенном слое (0–10 см) выявлены условно патогенные грибы, относящихся к родам Penicillium, Aspergillus, Mucor и Fusarium spp. представители которых способны поражать сельскохозяйственные культуры, быстро разрастаясь (размножаясь) и продуцируя фитотоксичные вещества [ 1].

Известно, что лектины способствуют формированию устойчивости растения к заражению микроорганизмами аналогично иммунной системе иммуно-компетентных организмов. Они фиксируют фитопатогены, а инфекционный процесс начинает развиваться в случае нарушения этой «линии защиты» [2]. Специфическое признание экзогенных углеводных структур лектинов свидетельствует о том, что они могут играть роль в создании оборонительные системы. Известно, что некоторые растительные лектины индуцируются во время стресса и увеличивают защитную реакцию при атаках бактерий, насекомых и фитопатогенных грибов [3].  Одним из признаков активной реакции растений на инфицирование является количественное изменение содержания или активности лектиновых белков [4].    

Целью данной работы являлось изучение лектиновой активности у проростков яровой пшеницы (Triticum aestivum  L.) сорта Омская-33 при инфицировании фитопатогенными грибами Fusarium oxysporum и Aspergillus niger. 

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили проростки яровой пшеницы сорта Омская-33. Семена пшеницы  выращивали в лабораторных условиях в кюветах на водопроводной воде. Инфицирование растений грибами (в концентрации (1-3)•104 КОЕ/см3) проводили на 7-ой день выращивания растений. Семисуточные проростки опытных вариантов в течение 1 часа выдерживали в водном растворе со спорами грибов Fusarium oxysporum и Aspergillus niger. Начальный уровень активности белков определяли через 1 час после инокуляции, последующие образцы отбирали через каждые сутки (на протяжении 4 суток).

Для экстрагирования растворимых лектинов навеску растительного материала (0,5 г. корней) гомогенизировали в 5 мл 0.05 н. HCl при соотношении навеска: среда 1:10, постоянно перемешивая в течение одного часа при 4ºС. Известно, что лектины экстрагируются больше в кислой среде (0.05 н. HCl), чем в нейтральной (0,01 М фосфатно-буферная смесь (ФБС)) [Луцик, 1981]. Затем экстракт центрифугировали при 8000g в течение 10 минут и промывали половинным от исходного объемом кислоты. Надосадочные жидкости собирали, нейтрализовывали 10%-ным раствором KOH в соотношении щелочь:экстракт 1:2, а супернатант повторно центрифугировали и использовали для определения лектиновой активности. Осадок использовали для выделения лектинов клеточной стенки.

Осадок после экстрагирования растворимых лектинов гомогенизировали в среде, содержащей 5 мМ ацетатного буфера (pH 4.6), содержащего 0.4 М сахарозы и центрифугировали при 8000g в течение 10 минут. Надосадочные жидкости сливали, а осадок дважды последовательно промывали, осаждая центрифугированием.  Далее осадок промывали на нейлоновой ткани большим количеством 5 мМ ацетатного буфера (pH 4.6). Из оставшегося на ткани твердого осадка, содержащего клеточные стенки, лектины экстрагировали исходной средой с добавлением (в конечной концентрации) 0.05% тритона Х-100, 0.9% NaCl и 0,5 мМ ФМСФ. Так как тритон Х-100 состоит из неионных детергентов на основе полиэтиленгликоля, которые растворяют мембрану и защищают компоненты мембраны алифатическими или ароматическими цепями, то он способствует вытеснению прочно связанного белка. Настаивали 3 часа при 2º С и постоянном перемешивании, затем центрифугировали 10 минут при 8000g. Осадок отбрасывали, а супернатант (фракция, обогащенная лектинами клеточных стенок) использовали для определения активности лектинов. Белок определяли по методу Лоури. Для проведения реакции гемагглютинации готовили 2% суспензию трипсинизированных эритроцитов I группы крови. Лектиновую активность определяли методом микротитрования. Реакцию проводили в специальных планшетах для иммунологических реакций с U-образными лунками. Для этого готовили серию последовательных двукратных разведений белкового экстракта лектинов (10 разведений) по 0.05 мл, в каждую лунку добавляли 0.05 мл 2%-ной суспензии эритроцитов и смесь оставляли при комнатной температуре на 60-120 минут. Активность лектинов рассчитывали по минимальной концентрации белка, вызывающей агглютинацию эритроцитов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

В наших исследованиях при действии фитопатогена Fusarium oxysporum первый пик  изменения активности растворимых мы наблюдали уже через 24 ч после инфицирования, а второй – через 72 ч. Такое повышение активности лектинов может свидетельствовать о вовлечении растворимых лектинов в ответную реакцию растений на инфицирование, связывание и запуск сигнальных систем, что бесспорно указывает на участие лектинов и лектиноподобных белков в формировании реакции-ответа на воздействие патогена.  Спад лектиновой активности к 10-м суткам обусловлен тем, что при взаимодействии растения-хозяина и чужеродного агента происходит максимальное связывание имеющимися молекулами лектина и лектиноподобных белков чужеродных клеток, торможение проникновения и дальнейшего распространения патогена.

Изменения активности лектинов клеточной стенки имели другой характер. Инфицирование Fusarium oxysporum вызывало подавление активности лектинов клеточной стенки в течение первых двух суток после добавления грибов в среду выращивания, а на третьи сутки происходило значительное увеличение активности этой группы белков. Через 96 ч уровень активности лектинов клеточной стенки вновь был ниже по сравнению с контрольными растениями.

Известно, что клеточная стенка является первым барьером, с которым взаимодействует фитопатоген, а лектины и лектиноподобные белки клеточной стенки участвуют в распознавании и иммобилизации чужого, а также в передаче внешнего сигнала в различные компартменты клетки. [ 5].    Можно предположить, что на первых этапах инфицирования существующие в клеточной стенке углеводсвязывающие центры лектинов взаимодействуют с инфекционными структурами патогенов, поэтому мы наблюдаем подавление активности лектинов клеточной стенки в первые и вторые сутки. Повышение активности лектинов клеточной стенки на третьи сутки можно соотнести с очередным синтезом белков, которые затем вновь вступают в реакцию с фитопатогеном. 

Динамика активности  лектинов фитопатогена Aspergillus niger, отличалась от динамики гриба  Fusarium oxysporum. Аspergilius niger также вызывал появление двух пиков активности растворимых лектинов через 24 ч и 72 ч, но, в отличие от Fusarium oxysporum, максимальный пик пришелся на 24 ч после инкубации растений в растворе спор патогена. При инфицировании Aspergillus niger активность лектинов, связанных с клеточной стенкой, повышалась через 24 ч после начала эксперимента, в ходе дальнейших измерений изменений активности этих белков мы не наблюдали.

В нашем эксперименте при инфицирования Aspergillus niger наблюдался более низкий уровень активности растворимых лектинов и лектинов клеточной стенки проростков яровой пшеницы Омская -33 по сравнению с инфицированием Fusarium oxysporum. Эти данные могут свидетельствовать о качественных изменениях в функционировании их лектин-лигандной системы, что, по нашему мнению, обусловлено уровнем устойчивости к данному фитопатогену.

Известно, что Фузариум – относятся к группе полевых грибов, проникает в растение непосредственно из почвы через корневые волоски и движется по сосудистым пучкам растения в колос. Аспергиллы же – относятся к грибам хранения и в основном поражают зерна пшеницы в хранилищах при благоприятной влажности воздуха. Заражение грибами хранения происходит снаружи с поверхности зерна, при попадании на нее спор плесневых грибов. И лишь потом, начав развиваться, плесневые грибы постепенно проникают и во внутренние ткани зерна, к зародышу [6].    Таким образом разные способы проникновения фитопатогенных грибов и воздействие на растение-хозяин предполагают разнообразные защитные реакции на воздействие патогенов.

Кроме того, эти изменения обусловливают появление в клетках растений-хозяев биохимических метаболитов и белков, которые могут ингибировать развитие патогена или повреждать его [7].

Согласно данным литературы, лектины связываются с экзогенными углеводными структурами и могут играть роль в создании оборонительной системы от фитопатогенов, так как индуцируются во время стресса и показывают ответную реакцию на действие грибов [3,8].  Возможно, что отличия в динамике активности лектинов пшеницы при инфицировании фитопатогенами разной природы Fusarium oxysporum и Aspergillus niger могут быть связаны с процессами проникновения гриба на растение-хозяин. При этом исходя из результатов исследования, можно предположить, что растения яровой пшеницы сорта Омская - 33 обладают большей чувствительностью к Fusarium oxysporum по сравнению с грибом Aspergillus niger, что, вероятно, связано с различной специфичностью данных патогенов к растениям пшеницы.

Список литературы:

1. Саламатин В.Н. Отчет о фитосанитарном обследовании посевов озимой пшеницы СЗАО «СКВО» г. Ростов-на-Дону 2016.
2. Сытников Д.М., КоцьС.Я. Участие лектинов в физиологических процессах // Физиология и биохимия культ. растений. Киев, 2009. Т.41. №4.
3. Chang-Shan Chen1,2, Chun-Yi Chen1,3, Divya Malathy Ravinath1, Agustina Bungahot1, Chi-Ping Cheng3 and Ren-In You1. Functional characterization of chitin-binding lectin from Solanum integrifolium containing anti-fungal and insecticidal activities // Chen et al. BMC Plant Biology (2018) 18:
4. Тимофеева О.А., Хусаинова Р.Р., Невмержицская Ю.Ю. Активность и состав лектинов клеточной стенки пшеницы при инфицировании грибными патогенами // Известия Самарского научного центра Российской академии наук, том 18, №2, 2016
5. Lectin Activity of Different Cell Fractions of Winter Wheat Seedlings under Pathogenesis Y.M. Pysmenna*, O.O. Panyuta, N.Yu. Taran Taras Shevchenko National University of Kyiv, Educational and Scientific Centre “Institute of Biology and Medicine”, Kyiv, 03022, Ukraine. Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 13, No. 1, 2017, pp. 44-51
6. Волкова Т.Н. Оценка зараженности зерна ячменя и солода плесневыми грибами// Контроль Качества, Москва, 2010, 2
7. Чесноков Ю.В. Устойчивость растений к патогенам // Сельскохозяйственная биология, 2007, 1
8. Lannoo N, Van Damme EJ. Lectin domains at the frontiers of plant defense // Front Plant Sci. 2014;5:397.