МЕТОД ДЕТЕКЦИИ ЭНДОТОКСИНОВ НА ОСНОВЕ РЕЦЕПТОРНЫХ БЕЛКОВ БАКТЕРИОФАГОВ

МЕТОД ДЕТЕКЦИИ ЭНДОТОКСИНОВ НА ОСНОВЕ РЕЦЕПТОРНЫХ БЕЛКОВ БАКТЕРИОФАГОВ

Лазарев Иван Витальевич

студент, Первый Московский государственный медицинский университет,

РФ, г. Москва

АННОТАЦИЯ

В данной статье предложен метод обнаружения эндотоксинов, основанный на комплементационной бимолекулярной флуоресценции – BiFC. В нем используются рецепторные белки бактериофагов Т4 и Т7 ,к которым посредством линкерной последовательности прикрепляются фрагменты флуоресцентного белка YFP. Рецепторные белки фиксируются рядом на эндотоксине, что приводит к связыванию фрагментов YEP и визуализации присутствия эндотоксина.

ABSTRACT

In this article, a method for detecting endotoxins based on complementary bimolecular fluorescence (BiFC) is proposed. It uses the receptor proteins of bacteriophages T4 and T7 ,to which fragments of the fluorescent protein YFP are attached by means of a linker sequence. Receptor proteins are fixed side by side on the endotoxin, which leads to the binding of YEP fragments and visualization of the presence of endotoxin.

Ключевые слова: ЛПС, бактериофаг, BiFC, детекция эндотоксинов, рецепторный белок.

Keywords: LPS, bacteriophage, BiFC, endotoxin detection, receptor protein.

Актуальность. Несмотря на множество существующих методов диагностики [1], большинство из них недостаточно практичны и слишком дороги, чтобы конкурировать с популярным на рынке LAL-тестом, использование которого сопряжено с уменьшением численности мечехвостов [2].

Эндотоксины, попавшие в организм человека, могут инициировать сильную воспалительную реакцию, поэтому методы обнаружения эндотоксинов крайне важны в практической медицине. Дальнейшее развитие данного метода может помочь в получение быстрого и удобного метода детекции эндотоксинов.

Основная часть. В 1977 году Picken RN и Beacham IR составили предположительную карту областей адсорбции вирусных белков на бактериальном эндотоксине, основываясь на результатах взаимодействия фагов с мутантными бактериями, различными в структурах ЛПС [3] (рис.1)

Рисунок 1. Картирование рецепторных сайтов на ЛПС . Picken RN и Beacham IR

В рамках нашего метода детекции мы можем использовать рецепторные белки gp12 и gp17 бактериофагов T4 и T7. Эти бактериофаги сегодня достаточно хорошо изучены. Данные белки связываются консервативными участками ЛПС, это обеспечивает большую универсальность теста, также, сайты их связывания расположены рядом, что также благоприятствует использованию BiFC.

Выбранные белки можно связать с комплементарными фрагментами флуоресцентного белка YFP, разделенного по 155-ому аминокислотному остатку, посредством гибкого линкера [6].

Слияние N- и С-концевых фрагментов репортерного белка YFP будет происходить, когда белки, адсорбированные на ЛПС, будут расположены достаточно близко для их взаимодействия.

Схематично этот процесс представлен на рисунке 2

Рисунок 2. Схема работы системы BiFC на основе рецепторных белков, гибких линкеров и флуоресцентного белка YFP 

gp17 – синий квадрат, gp12 – оранжевый квадрат, треугольники – фрагмент YFP, кривая прямая – линкер, желтый прямоугольник – флуоресцирующий YFP

1 – созданные фрагменты свободно плавают в растворе. 2 – рецепторные белки прикрепляются к поверхности ЛПС. 3- фрагменты репортерного белка на линкерах сливаются, образуя флуоресцентный белок YFP

Подобный подход уже был использован для РНК [7].

Обсуждение и перспективы. Метод имеет ряд преимуществ, характерных для BiFC: большая чувствительность, прямая визуализация, удобство использования, работа без труднодоступного оборудования.

Метод может быть усовершенствован при использование более специфичных белков с точно известной локализацией, чему сегодня препятствует малая изученность рецепторных белков бактериофагов. Представляется перспективным так же и использование более двух рецепторов для нейтрализации ложноотрицательных результатов вследствие отсутствия на эндотоксине сайта связывания конкретного рецептора.

Список литературы:

1. Elvina Clarie Dullah & Clarence M. Ongkudon (2017) Current trends in endotoxin detection and analysis of endotoxin–protein interactions, Critical Reviews in Biotechnology, 37:2, 251-261, DOI: 10.3109/07388551.2016.1141393
2. Gorman Richard. (2020) Atlantic Horseshoe Crabs and Endotoxin Testing: Perspectives on Alternatives, Sustainable Methods, and the 3Rs (Replacement, Reduction, and Refinement), Frontiers in Marine Science, 2296-7745, DOI:10.3389/fmars.2020.582132
3. Picken RN, Beacham IR. Bacteriophage-resistant mutants of Escherichia coli K12. Location of receptors within the lipopolysaccharide. J Gen Microbiol 1977;102:305‒18, DOI: 10.1099/00221287-102-2-305.
4. Galarneau, A., Primeau, M., Trudeau, LE. et al. β-Lactamase protein fragment complementation assays as in vivo and in vitro sensors of protein–protein interactions. Nat Biotechnol 20, 619–622 (2002). DOI: 10.1038/nbt0602-619.
5. Xu XM, Moller SG. 2006 Xu XM, Moller SG. 2006. AtSufE is an essential activator of plastidic and mitochondrial desulfurases in Arabidopsis, 25:900-909, DOI:10.1038/sj.emboj.7600968
6. Xiaoying Chen, Jennica L. Zaro, Wei-Chiang Shen: Fusion protein linkers (2013) Property, design and functionality, advanced Drug Delivery Reviews, 1357-1369, DOI:10.1016/j.addr.2012.09.039
7. Oliver Rackham, Chris M Brown, (2004), Visualization of RNA–protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs, The EMBO jornal, 23:3346-3355, DOI:10.1038/sj.emboj.7600341