КОРРЕЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ИЗМЕНЕНИЙ АКТИВНОСТИ КАЛЬЦИНЕЙРИНА, ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ И АНТИОКСИДАНТНЫХ ФАКТОРОВ У БОЛЬНЫХ ПЕРВИЧНЫМ РАКОМ ЯИЧНИКОВ

КОРРЕЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ИЗМЕНЕНИЙ АКТИВНОСТИ КАЛЬЦИНЕЙРИНА, ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ И АНТИОКСИДАНТНЫХ ФАКТОРОВ У БОЛЬНЫХ ПЕРВИЧНЫМ РАКОМ ЯИЧНИКОВ

Унанян Овсанна Ваниковна

канд. биол. наук, науч. сотр. Института биохимии имени Г. Х. Бунятяна Национальной академии наук Республики Армения,

Армения г. Ереван

Закарян Эрмине Арутюновна

канд. биол. наук, науч. сотр. Института биохимии имени Г. Х. Бунятяна Национальной академии наук Республики Армения,

Армения г. Ереван

Саруханян Флора Петросовна

канд. биол. наук, ст. науч. сотр., руководитель лаборатории Биохимии нейропептидов Института биохимии имени Г. Х. Бунятяна Национальной академии наук Республики Армения,

Армения г. Ереван

АННОТАЦИЯ

Нами впервые было показано вовлеченность кальцинейрина в патофизиологию первичного рака женских репродуктивных органов. Также выявлено органоспецифичность и стадия-зависимый характер изменений активности кальцинейрина, некоторых его партнеров (каталаза и глутатион) и нижестоящих мишеней (IL-2, TNF-α) в плазме и в опухолевой ткани онкологических больных с I, II, III стадией первичного рака яичников. В данной работе представлен корреляционный анализ с целью оценить взаимосвязь обнаруженных изменений активности/уровней воспалительных и антиоксидантных факторов с активностю кальцинейрина. Результаты показали, что изменения уровней цитокинов, а также изменения активности каталазы и уровня глутатиона при патофизиологии первичного рака яичников зависят от активности кальцинейрина.

ABSTRACT

We have shown for the first time the involvement of calcineurin in the pathophysiology of primary cancer of the female reproductive organs. Organ-specificity and stage-dependent nature of changes in the activity of calcineurin, some of its partners (catalase and glutathione) and downstream targets (IL-2, TNF-α) in plasma and tumor tissue of patients with I, II, III stages of primary ovarian cancer were also revealed. In this work a correlation analysis is presented to assess the relationship of the detected changes in the activity/levels of inflammatory and antioxidant factors with calcineurin activity. The results demonstrated that changes in cytokine levels as well as changes in catalase activity and glutathione levels in the pathophysiology of primary ovarian cancer depend on calcineurin activity.

Ключевые слова: рак яичников, кальцинейрин, каталаза, глутатион, интерлейкин-2, фактор некроза опухолей альфа, корреляционный анализ.

Keywords: ovarian cancer, calcineurin, catalase, glutathione, interleukin-2, tumor necrosis factor alpha, correlation analysis.

Злокачественные опухоли репродуктивной системы являются самыми частыми среди онкологических болезней женщин в Армении после рака молочной железы [1]. Ранее нами была выдвинута гипотеза, что изменения активности Ca²⁺/кальмодулин (CaM)-зависимой протеинфосфатазы кальцинейрина (CN или PP2B) при патофизиологии злокачественных новообразований могут быть не только органоспецифичными, но и зависеть от стадии заболевания и других факторов. Действительно, нам удалось впервые показать не только вовлеченность CN в патофизиологию первичного рака женских репродуктивных органов, но и выявить органоспецифичность и стадия-зависимый характер изменений активности CN в плазме и в опухолевой ткани онкологических больных с I, II, III стадией первичного рака яичников, тела матки и шейки матки [2-4]. Было обнаружено, что изменения активности CN при патофизилогии рака женских репродуктивных органов также зависят от степени гистологической дифференциации, но не было обнаружено статистически значимой корреляции с возрастом больных. CN тесно взаимодействует с компонентами иммунной и окислительной/антиоксидантной систем, которые, как и CN участвуют в патогенезе рака. Поэтому, параллельное изучение активностей и уровней некоторых его партнеров (каталаза (CAT) и глутатион (GSH)) и нижестоящих мишеней (интерлейкин (IL)-2, TNF-α) в плазме и в самой опухоли в зависимости от стадии первичного рака яичников также впервые выявил органоспецифичность и стадия-зависимый характер изменений активности CAT, а также уровней IL-2, TNF-α, GSH [5-7]. Однако, чтобы выяснить насколько обнаруженные нами изменения активности/уровней воспалительных и антиоксидантных факторов, наблюдаемых при патофизиологии первичного рака яичников, связаны с изменениями активности CN, был проведен корреляционный анализ, который представлен в данной работе.

Материалы и методы: Все измерения проводились повторно не менее 3 раз. Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро-Уилка. Полученные данные были статистически обработаны методом дисперсионного анализа (one-way ANOVA) с использованием программного пакета Origin 6.1 (OriginLab Corp., USA). Разница между данными считалась статистически достоверной при  р<0,05.

Корреляционный анализ проводился с использованием программы StatTech v. 1.2.0 (ООО “Статтех”, Россия). Направление и теснота корреляционной связи между двумя количественными показателями оценивались с помощью коэффициента корреляции Пирсона (при нормальном распределении сопоставляемых показателей) или коэффициента ранговой корреляции Спирмена (при распределении показателей, отличном от нормального). Прогностическая модель, характеризующая зависимость количественной переменной от факторов, представленных количественными показателями, разрабатывалась с помощью метода парной линейной регрессии.

Результаты и обсуждение: С целю выяснить насколько обнаруженные нами ранее изменения уровня TNF-α и IL-2, наблюдаемых при патофизиологии первичного рака яичников [6], связаны с изменениями активности CN, был проведен корреляционный анализ взаимосвязи данных факторов. Как выдно из Таблицы 1, наблюдаемые в плазме и в опухолевой ткани изменения уровней IL-2 и TNF-α статистически значимо зависят от активности CN, за исключением уровня IL-2 в опухолевой ткани, что возможно обусловлено малым количеством наблюдений.

Наблюдаемая зависимость между уровнем TNF-α и активностью CN в плазме и в опухолевой ткани описывается соответсвенно уравнениям парной линейной регрессии:

Y_TNFα = 140,7 + 443,5 × X_CN                                                                    (1)

где: Y_TNFα – значение TNFα в плазме;

       X_CN – значение CN в плазме.

Y_TNFα = -127 + 75,16 × X_CN,                                                       (2)

где: Y_TNFα – значение TNFα в опухолевой ткани;

       X_CN – значение CN в опухолевой ткани.

При увеличении активности CN на 1 Ед/мг следует ожидать увеличение уровня TNFα на 443,5 пг/мл в плазме (Рис. 1а) и на 75,16 пг/мл в опухолевой ткани (Рис. 2а), соответственно.

Наблюдаемая в плазме и в опухолевой ткани больных первичным раком яичников зависимость уровня IL-2 от активности CN описывается соответственно уравнениям парной линейной регрессии:

Y_IL2 = 596,5 - 927,13 × X_CN,                                                        (3)

где: Y_IL2 – значение IL-2 в плазме;

       X _CN – значение CN в плазме.

Y_IL2 = 16,3 + 63,13 × X_CN,                                                         (4)

где: Y_IL2 – значение IL-2 в опухолевой ткани;

       X_CN – значение CN в опухолевой ткани.

При увеличении активности CN на 1 Ед/мг следует ожидать уменьшение уровня IL-2 на 927,13 пг/мл в плазме (Рис. 1b) и, наоборот, увеличение уровня IL-2 на 63,13 пг/мл в опухолевой ткани (Рис. 2b), хотя в последнем случае связь статистически не значима.

Интересна наблюдаемая нами закономерность изменений уровней TNF-α и IL-2 в противоположном направлении. Эти изменения взаимосвязаны, так как после стимуляции Т-клеток эти два центральных цитокина коэкспрессируются и совместно регулируются. Была идентифицирована одинаковая регуляторная область в промоторах генов IL-2 и TNF-α [8]. Она включает сайты связывания для транскрипционных факторов EGR (early growth response) и NFAT. Данные транскрипционные факторы функционально взаимодействуют образуя гетеродимеры, которые, по-видимому, ответственны за скоординированную экспрессию генов обоих этих цитокинов [8]. Возможно при наблюдаемой нами патофизиологии после активации CN/NFAT сигнального пути образующийся комплекс EGR-NFAT, связываясь с промоторами генов IL-2 и TNF-α, индуцирует экспрессию этих генов в противоположном направлении. Чтобы выяснить насколько изменения уровней TNF-α и IL-2 взаимосвязаны в данном случае, был также проведен корреляционный анализ, который, однако, обнаружил заметную отрицательную корреляцию между этими цитокинами в плазме больных первичным раком яичников (r=-0.67, p=0.008), а в опухолевой ткани эта связь слабая и статистически незначимая (r=0.24, p>0.05).

Таблица 1.

Результаты корреляционного анализа взаимосвязи изменений активности/уровней воспалительных и антиоксидантных факторов и кальцинейрина у больных первичным раком яичников

* – связь показателей статистически значима (p<0,05)

Рисунок 1. График регрессионной функции, характеризующий зависимость уровней TNF-α (а), IL-2 (b), GSH (d) и активности CAT (c) от активности кальцинейрина в плазме больных первичным раком яичников

Корреляционный анализ также выявил статистически значимую положительную корреляцию между активностью CAT и CN (Таблица 1), которая описывается соответсвенно следующим уравнениям парной линейной регрессии:

Y_CAT = -16,7 + 278,5 × X_CN,                                                         (5)

где: Y_CAT – значение CAT в плазме;

       X_CN – значение CN в плазме.

Y_CAT = 25,3 + 94,9 × X_CN,                                                        (6)

где: Y_CAT – значение CAT в опухолевой ткани;

          X_CN – значение CN в опухолевой ткани.

При увеличении активности CN на 1 Ед/мг следует ожидать увеличение активности CAT на 278,5 Ед/мл в плазме (Рис. 1c) и на 94,9 Ед/мл в опухолевой ткани (Рис. 2c).

Эти данные, а также наши данные, показавшие стадия-зависимые изменения активности CAT параллельно изменениям активности CN при патофизиологии первичного рака яичников [7], являются доказательством того, что CAT поддерживает активность CN.   

Рисунок 2. График регрессионной функции, характеризующий зависимость уровней TNF-α (а), IL-2 (b), GSH (d) и активности CAT (c) от активности кальцинейрина в опухолевой ткани больных первичным раком яичников

Известно, что GSH также защищает дисульфидные связи CN от атак АФК, тем самым, защищая CN от инактивации [9]. Однако, в отличие от плазмы, в опухолевой ткани мы наблюдаем постепенное снижение уровня GSH в зависимости от стадии заболевания, что еще раз свидетельствует, что GSH защищает CN от инактивации [5]. В пользу этого утверждения говорит и обнаруженная корреляционным анализом статистически значимая заметная связь между уровнем GSH и активностью CN.

Наблюдаемая в плазме и в опухолевой ткани статистически значимая зависимость уровня GSH от активности CN (Таблица 1) описывается соответственно уравнениям:

Y_GSH = -0,14 + 1,7 × X_CN,                                                      (7)

где: Y_GSH – значение GSH в плазме;

       X _CN – значение CN в плазме.

Y_GSH = 4,9 - 0,8 × X_CN,                                                      (8)

где: Y_GSH - значение GSH в опухолевой ткани;

       X_CN – значение CN в опухолевой ткани.

При увеличении активности CN на 1 Ед/мг следует ожидать увеличение уровня GSH на 1,7 мкМ в плазме (Рис. 1d) и, наоборот, уменьшение уровня GSH на 0,8 мкМ в опухолевой ткани (Рис. 2d).

Итак, обобщая вышеизложенное, можно подчеркнуть, что изменения уровней цитокинов IL-2 и TNF-α, в синтезе которых участвует кальцинейрин, при патофизиологии первичного рака яичников зависят от активности кальцинейрина. Изменения уровней данных цитокинов также взаимосвязаны. Изменения активности каталазы и уровня глутатиона при патофизиологии первичного рака яичников также зависят от изменений активности кальцинейрина, что является еще одним доказательством того, что каталаза и глутатион защищают кальцинейрин от инактивации.

Список литературы:

1. https://nih.am/am/statistical_yearbooks/161/am
2. Sarukhanyan F.P., Hovhannisyan G.A., Hunanyan O.V., Zakaryan H.H., Barkhudaryan N.H. The study of calcineurin activity in pathophysiology of ovarian cancer, Biolog. Journal of Armenia, v. 3 (69), 2017, p. 159-163.
3. Sarukhanyan F. P., Hovhannisyan G. A., Hunanyan O. V., Barkhudaryan N. H.  Involvement of calcineurin in the pathophysiology of endometrial cancer. Medical Journal of Armenia, 2019, v.79, №4, p. 32-41.
4. Hovhannisyan G. A., Sarukhanyan F. P., Zakaryan H. H., Barkhudaryan N. H. Antioxidative and Immunological Patterns of Cervical Cancer Progression. Reports NAS RA, 2019, v. 119, № 4, p. 324-331.
5. Hovhannisyan G. A. Changes in Glutathione Activity in HYPERLINK "http://medsci.asj-oa.am/6336/"PathophysiologyHYPERLINK "http://medsci.asj-oa.am/6336/" of Reproductive Organs Cancers. Medical Journal of Armenia, 2019, v. 79, № 3, p. 83-89.
6. Hovhannisyan G. A. IL-2 and TNF-HYPERLINK "http://biology.asj-oa.am/11609/"αHYPERLINK "http://biology.asj-oa.am/11609/" activity in ovarian cancer depends on the stage of disease.HYPERLINK "http Biolog. Journal of Armenia, 2019, v. 71, № 3, p. 53-59.
7. Hovhannisyan G. A., Sarukhanyan F. P., Hunanyan O. V., Barkhudaryan N. H. Changes in Catalase Activity Depending on Stages of Gynecological Cancers. Reports NAS RA, 2019, v. 119, № 3, p. 274-280.
8. Decker E. L., Nehmann N., Kampen E., Eibel H., Zipfel P. F., Skerka Ch. Early growth response proteins (EGR) and nuclear factors of activated T cells (NFAT) form heterodimers and regulate proinfammatory cytokine gene expression. Nucleic Acids Research, 2003, 31 (3):911-921.
9. Liou G-Y., Storz P. Reactive oxygen species in cancer. Free Radic Res. 2010; doi:10.3109/10715761003667554.