ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ NR2 – АНТИТЕЛ В ДИАГНОСТИКЕ РАЗВИТИЯ ИШЕМИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА НА ДОГОСПИТАЛЬНОМ ЭТАПЕ

ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ NR2 – АНТИТЕЛ В ДИАГНОСТИКЕ РАЗВИТИЯ ИШЕМИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА НА ДОГОСПИТАЛЬНОМ ЭТАПЕ

Мирошниченко Юлия Александровна

канд. мед. наук, заведующий клинико-диагностической лабораторией, Ростовская клиническая больница,

РФ, г. Ростов-на-Дону

Прокопенко Светлана Владимировна

биолог, Ростовская клиническая больница,

РФ, г. Ростов-на-Дону

EVALUATION OF THE POSSIBILITY OF USING THE DETERMINATION OF NR2 – ANTIBODIES IN THE DIAGNOSIS OF ISCHEMIC STROKE AT THE PREHOSPITAL STAGE

Yulia Miroshnichenko

Candidate of Medical Sciences, Head of the Clinical Diagnostic Laboratory, Rostov Clinical Hospital,

Russia, Rostov-on-Don

Svetlana Prokopenko

Biologist, Rostov Clinical Hospital,

Russia, Rostov-on-Don

АННОТАЦИЯ

Учитывая, что сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смертности и потери трудоспособности, на сегодняшний день, важной социально-экономической задачей является предотвращение и эффективное лечение данных заболеваний. Раннее выявление повреждений головного мозга у лиц, не страдающих неврологическими заболеваниями, но имеющих повышенный риск из-за сопутствующих сосудистых заболеваний и факторов риска, является приоритетной задачей клиницистов. В последнее время появляются сообщения, что белки NMDA-рецептора и их антитела, могут иметь связь с бессимптомными сосудистыми поражениями головного мозга.  Ввиду этого нами было проведено пилотное исследование по оценке возможности применения определения NR2 – антител в диагностике развития ишемического инсульта на догоспитальном этапе. Материалы и методы: В настоящей работе представлены результаты обследования 91 пациента, среди которых 62 женщины в возрасте 58,9±1,62 лет и 29 мужчин – 59,5±2,44 лет. Исследованы сывороточные уровни NR2-антител методом иммуноферментного анализа у пациентов при проведении углубленной диспансеризации. Преимущественный диагноз у данных пациентов – гипертоническая болезнь и сахарный диабет 2 типа. Также у 30 пациентов в анамнезе присутствовал лабораторно подтвержденный результат на перенесенный ранее Sars-CoV-2. Результаты: Статистически и прогностически значимых изменений не было выявлено. Однако, учитывая большое количество сообщений о возможности применения NR2-антител в качестве предиктора ишемического инсульта, стоит рассмотреть возможность более углубленного изучения данного белка.

ABSTRACT

Considering that cardiovascular diseases are the main cause of mortality and disability, today, an important socio-economic task is the prevention and effective treatment of these diseases. Early detection of brain damage in people who do not suffer from neurological diseases, but have an increased risk due to concomitant vascular diseases and risk factors, is a priority for clinicians. Recently, there have been reports that NMDA receptor proteins and their antibodies may be associated with asymptomatic vascular lesions of the brain. In view of this, we conducted a pilot study to assess the possibility of using the determination of NR2 antibodies in the diagnosis of the development of ischemic stroke at the prehospital stage. Materials and methods: This paper presents the results of examination of 91 patients, including 62 women aged 58.9 ± 1.62 years and 29 men – 59.5± 2.44 years. Serum levels of NR2-antibodies were studied by enzyme immunoassay in patients undergoing in-depth medical examination. The predominant diagnosis in these patients is hypertension and type 2 diabetes mellitus. Also, 30 patients had a history of laboratory-confirmed results for previously transferred Sars-CoV-2. Results: Statistically and prognostically significant changes were not detected. However, given the large number of reports about the possibility of using NR2 antibodies as a predictor of ischemic stroke, it is worth considering the possibility of a more in-depth study of this protein.

Ключевые слова: NMDA-рецептор, NR2-антитела, ишемический инсульт, лабораторная диагностика, цереброваскулярная патология

Keywords: NMDA receptor, NR2 antibodies, ischemic stroke, laboratory diagnostics, cerebrovascular pathology

Введение

Учитывая, что сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смертности и потери трудоспособности, на сегодняшний день, важной социально-экономической задачей является предотвращение и эффективное лечение данных заболеваний. В настоящее время, в России, инсульт занимает 2 место в структуре общей смертности [1]. Раннее выявление повреждений головного мозга у лиц, не страдающих неврологическими заболеваниями, но имеющих повышенный риск из-за сопутствующих сосудистых заболеваний и факторов риска, является приоритетной задачей клиницистов.

Заболевание мелких сосудов головного мозга является не только основной причиной инсульта (как ишемического, так и геморрагического), но и играет ключевую роль в развитии когнитивных нарушений, деменции и некогнитивных расстройств, таких как нарушения походки и равновесия [2,3]. При заболеваниях мелких сосудов головного мозга основные патологические изменения включают эндотелиальную дисфункцию, разрушение гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), воспаление и артериолосклероз в результате незначительного и сохраняющегося повреждения, которому паренхима головного мозга подвергается в течение десятилетий из-за старения, артериальной гипертензии, сахарного диабета и других сосудистых факторов риска. Помимо этого, стоит также обратить внимание на то, что человечество столкнулось с ковидной пандемией, отдаленные последствия которой мы наблюдаем сейчас. Не менее чем у трети пациентов, перенесших ковид, наблюдаются неврологические расстройства, среди которых отмечаются когнитивные нарушения, спутанность сознания, инсульты, периферические невропатии. Наиболее вероятными механизмами поражения нервной системы при COVID-19 являются патологические иммунные реакции, цереброваскулярные заболевания в связи с коронавирусным эндотелиитом и гипоксическая травма мозга; обсуждается также прямое нейротропное воздействие вируса [4]. Все это способствует медленному, непрерывному высвобождению цитозольных и мембранных белков из поврежденных клеток головного мозга в спинномозговую жидкость (ликвор) и интерстициальную жидкость, попадая в кровь через нарушенный ГЭБ.

Что касается прогнозирования субклинических повреждений головного мозга, то в последнее время наблюдается повышенный интерес научного сообщества к экспрессируемым в мозговой ткани специфическим белкам или аутоантителам против них.

Белки, синтезируемые головным мозгом, более специфичны в качестве потенциальных маркеров его повреждения. Наблюдается стремительный рост в измерении различных специфичных белков для оценки степени повреждения ЦНС при различных неврологических состояниях (инсульт, черепно-мозговая травма и т.д.) для дифференциальной диагностики, мониторинга прогрессирования и прогнозирования неврологического исхода [5-7]. Исследование белков мозга стало возможно благодаря двум факторам: 1) при многих заболеваниях ЦНС ГЭБ в некоторой степени нарушается, что позволяет специфическим белкам высвобождаться или секретироваться из поврежденных нервных клеток в кровоток и 2) разработка более чувствительных методов определения этих специфичных молекул, которые находятся в очень низких концентрациях в крови.

Рецептор N-метил-D-аспартата (NMDA)

В качестве биомаркеров ишемии головного мозга и инсульта были предложены белки NMDA-рецептора и их антитела (NR2) [8]. Исследования данных белков основаны на патофизиологических аспектах ишемического повреждения тканей и вероятности повышения их уровня в крови.

Рецептор N-метил-D-аспартата (NMDA), входящий в число ионотропных глутаматных рецепторов, является основополагающим для интеграции и передачи сложной сигнализации в нейронах. NMDA-рецептор представляет собой тетрамер с двумя глицинсвязывающими NR1 и двумя глутаматсвязывающими NR2 субъединицами. В результате глутаминергической нейротрансмиссии большое количество глутамата высвобождается в синаптической щели, воздействуя на соответствующие рецепторы. Транспортеры глутамата, локализованные в основном в астроцитах, поглощают глутамат и нейтрализуют его до глютамина. Передача сигналов NMDA-рецептором опосредуется проницаемостью для Ca2+ и большой сетью сигнальных белков, связанных в основном с C-концевым доменом субъединиц NR2. Каждая отдельная субъединица структурно схожа и состоит из внеклеточного N-концевого домена, трех трансмембранных областей (M1, M3, M4), одной петли (M2, которая формирует мощность канала) и внутриклеточного N-концевого домена. Сайт связывания лиганда для глутамата локализован в N-концевом домене, в то время как C-концевой домен взаимодействует с внутриклеточными сигнальными мессенджерами, включая постсинаптические белки. Роль NMDA-рецепторов хорошо отражена в многочисленных публикациях, которые описывают изменение состава субъединиц NMDA-рецепторов в процессе развития и их фундаментальную роль в формировании синапсов и созревании нейронов [9-11].     

Было отмечено, что при ишемии головного мозга высвобождается избыток глутамата, вызывая нарушение регуляции NMDA-рецепторов в головном мозге и в эндотелиальных клетках микрососудов головного мозга, что приводит к внеклеточной перегрузке глутаматом, которая вызывает нейротоксичность. Избыточная активация NMDA-рецепторов, вероятно, вносит основной вклад в постишемическое повышение внутриклеточного Ca2+, которое индуцирует посттрансляционную модификацию этого рецептора внеклеточными и внутриклеточными протеазами, которые расщепляют N-концевые фрагменты субъединиц NR1 или NR2. Сообщалось, что пептид NR2 является продуктом деградации пресинаптических и экстрасинаптических NMDA-рецепторов в микрососудах и нейронах. NR2-подтипы NMDA-рецепторов расположены как в структурах головного мозга (главным образом в коре головного мозга), так и в эндотелии мозговых артерий, эпителии сплетений и эпендиме желудочков [9]. Эти небольшие пептидные фрагменты могут проникать через ГЭБ, скомпрометированный ишемией головного мозга и/ или ЧМТ, и попадать в кровоток [12, 13].

В ответ на циркуляцию пептидных фрагментов (NR2) в крови активируется системный адаптивный иммунный ответ (В- и Т-лимфоциты), который может не распознавать эти белки как собственные антигены, вызывая аутоиммунный ответ [14-16]. Аутоантитела могут выступать в качестве прогностических маркеров возникновения и прогрессирования заболевания, а также для оценки терапевтического ответа. 

Многие ученые проводили изучение содержания циркулирующих аутоантител в крови при различных неврологических расстройствах, и только в последнее десятилетие они привлекли внимание ученых в контексте прогнозирования бессимптомного повреждения головного мозга [17].

Alina González-Quevedo с соавт., провели исследование уровней циркулирующих антител к NR2 NMDA-рецептора у лиц с гипертонической болезнью. В группу были включены 47 неврологически бессимптомных пациентов с артериальной гипертензией.  Помимо определения концентрации NR2 в крови пациентам проводили МРТ головного мозга. Было выявлено, что повышенные уровни антител к NR2 в сыворотке крови отмечались у пациентов с более выраженными изменениями в структурах головного мозга по результатам МРТ, указывающими на заболевания мелких сосудов головного мозга: лейкоареоз, увеличенные пространства Вирхова-Робина и общий балл визуализации для субклинического повреждения головного мозга. При этом наличие лобной атрофии (измеряемая шириной лобной межполушарной щели) было обратно пропорционально количеству циркулирующих антител NR2. Авторы предположили, что низкая концентрация антител к NR2 при лобной атрофии происходит из-за уменьшения объема ткани. Следовательно, скрининг на раннее повреждение головного мозга с помощью антител к NR2, вероятно, был бы полезен в более молодых группах риска, где возрастная атрофия коры головного мозга еще не установлена [17].

Цель и задачи

Определить уровень циркулирующих антител к NR2 у пациентов при проведении углубленной диспансеризации и при выявлении прогностической значимости интегрировать данное исследование в рутинную практику.

Материалы и методы

Для выполнения поставленной задачи в исследование включен 91 пациент, среди которых 62 женщины в возрасте 58,9±1,62 лет и 29 мужчин – 59,5±2,44 лет. Данные пациенты являются прикрепленным контингентом клинико-диагностической поликлиники РКБ ФГБУЗ ЮОМЦ ФМБА России, проходившие углубленную диспансеризацию, в рамках которой был выполнен забор биоматериала на исследование.

Выполнялось определение количества антител к NR2. Материалом для исследования служила сыворотка крови.

Исследование проводилось методом иммуноферментного анализа наборами реагентов для количественного определения антител к NR2 субъединице NMDA рецептора глутамата в сыворотке крови человека («NR2АТ-ИФА»).

Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v. 3.0.5 (разработчик - ООО "Статтех", Россия).

Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Колмогорова-Смирнова (при числе исследуемых более 50).

В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывались с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q1 – Q3).

Категориальные данные описывались с указанием абсолютных значений и процентных долей.

Сравнение двух групп по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполнялось с помощью U-критерия Манна-Уитни.

Направление и теснота корреляционной связи между двумя количественными показателями оценивались с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (при распределении показателей, отличном от нормального).

Прогностическая модель, характеризующая зависимость количественной переменной от факторов, разрабатывалась с помощью метода линейной регрессии.

Результаты

Принимая во внимание исследование, проведенное учеными во главе с Alina González-Quevedo, где говорится о влияние возраста, а именно наличие лобной атрофии у лиц более старшего возраста [17], нами был выполнен корреляционный анализ взаимосвязи возраста и концентрации антител к NR2 (таблица 1).

Таблица 1.

 Результаты корреляционного анализа взаимосвязи показателя возраст и количество антител к NR2

При оценке связи количества антител к NR2 и возраста связь отсутствовала. Наблюдаемая зависимость антител к NR2 от показателя «возраст» описывается уравнением парной линейной регрессии:

Y_{Антитела к NR2} = -0,006 × X_{возраст} + 1,494

При увеличении показателя «возраст» на 1 следует ожидать уменьшение антител к NR2 на 0,006 нг/мл. Полученная модель объясняет 1,5% наблюдаемой дисперсии антител к NR2 (рисунок 1). Однако, не смотря на отсутствие какой-либо связи, мы можем видеть слабую тенденцию к уменьшению концентрации антител к NR2 с увеличением возраста, что косвенно позволяет нам поддержать предположение Alina González-Quevedo о влиянии объема мозговой ткани на концентрацию антител к NR2, так как в нашем исследовании принимали участие мужчины и женщины в возрасте преимущественно старше 58 лет.

Рисунок 1. График регрессионной функции, характеризующий зависимость концентрации антител к NR2 от возраста

Количество женщин, принимавших участие в исследовании, превалировало над количеством мужчин. Нами был проведен анализ количества антител к NR2 в зависимости от пола. При оценке количества антител к NR2 в зависимости от пола, нам не удалось выявить значимых различий (p = 0,404) (таблица 2, рисунок 2).

Таблица 2.

 Анализ концентрации антител к NR2 в зависимости от пола

Рисунок 2. Анализ концентрации антител к NR2 в зависимости от пола

Помимо возможного возрастного и гендерного влияния на концентрацию антител к NR2 в сыворотке мы предположили, что, учитывая циркуляцию новой короновирусной инфекции в популяции, она также могла являться фактором риска развития ишемического инсульта у пациентов, перенесших данную инфекцию. Среди обследуемых нами пациентов у 30 человек в анамнезе был лабораторно подтвержденный ковид. В виду этого был проведен анализ количества антител к NR2 в зависимости от перенесенного ковида (таблица 3). Данный анализ не установил статистически значимых различий (p = 0,704) (рисунок 3).

Таблица 3.

Анализ концентрации антител к NR2 в зависимости от перенесенного ковида

Рисунок 3. Анализ концентрации антител к NR2 в зависимости от перенесенного ковида

Одним из ведущих факторов риска в развитии ишемического инсульта является гипертоническая болезнь [18]. В нашем исследовании у 74 человек установлен диагноз гипертонической болезни. Ввиду этого мы проанализировали концентрацию антител к NR2 в зависимости от наличия или отсутствия гипертонической болезни. Однако, нам не удалось выявить значимых различий (p = 0,555)

Таблица 4.

Анализ концентрации антител к NR2 в зависимости от гипертонической болезни

Рисунок 4. Анализ концентрации антител к NR2 в зависимости от гипертонической болезни

Обсуждение

Данные, полученные в нашем исследовании, не подтвердили первоначальное предположение о возможности использования антител к NR2 в рутинной практике с целью выявления лиц, входящих в «группу риска» по развитию инсульта. Однако, учитывая данные мировой литературы, стоит задуматься об увеличении выборки пациентов, а также пересмотреть возрастной критерий включения в исследование. Помимо этого, необходимо дополнить исследование методами визуализации, например, МРТ головного мозга.

Поиск специфичных маркеров повреждения головного мозга является актуальной темой. Наличие у врача достоверной информации о хроническом повреждении головного мозга могло бы способствовать более корректному ведению пациентов с “высоким риском” с целью снижения будущих сосудистых осложнений (инсульт, снижение когнитивных способностей и деменцию).

Исследование различных биомаркеров в крови, на сегодняшний, является рутинной практикой. Однако, есть определенные сложности в определении биомаркеров специфичных для ЦНС. Такие известные маркеры воспаления как СРБ, ИЛ-6 или NT-proBNP не могут применяться для оценки повреждения нервной ткани, так как являются системными и не обладают необходимой специфичностью.

Несомненно, в этом направлении работы предстоит сделать еще очень много поскольку имеющиеся данные немногочисленны и исследуемые группы очень разнородны. Некоторые исследования были проведены в рамках популяционных обследований пожилых людей, в то время как другие исследовали стационарных и амбулаторных пациентов, третьи - бессимптомных лиц с сосудистыми факторами риска без возрастных ограничений. Кроме того, размеры выборки в значительной степени варьируются.

Но несмотря на это, те данные, которые мы имеем сегодня представляются многообещающими и могут стать будущим для первичной профилактики, мониторинга и снижения заболеваемости и смертности, связанных с цереброваскулярной патологией.

Список литературы:

1. Ма-Ван-дэ А.Ю. Эпидемиологические аспекты и факторы риска развития ишемического инсульта // ЭНИ Забайкальский медицинский вестник. – 2022. - № 2. С. 41-52. doi:10.52485/19986173_2022_2_41
2. Schreiber S. Invited Review: The spectrum of age-related small vessel diseases: potential overlap and interactions of amyloid and nonamyloid vasculopathies // Neuropathology and Applied Neurobiology. – 2019. – P. 1-20. doi.org/10.1111/nan.12576 
3. Cannistraro R. CNS small vessel disease. A clinical review // Neurology. -  2019. - № 92. Р. 1146-56. doi: 10.1212/WNL.0000000000007654.
4. Захаров В.В. Постковидный синдром глазами невролога // Поведенческая неврология. - 2021. - № 2. - С.14–22.doi:10.46393/2712-9675_2021_2_14_22
5. Bharosay A. Role of Brain Biomarker in Predicting Clinical Outcome in Hypertensive Cerebrovascular Ischemic Stroke // Indian journal clinical biochemistry. – 2017. – V. 33(2). Р.178-83. doi: 10.1007/s12291-017-0664-3.
6. Dambinova S. Biomarkers for Cerebral Ischemia as a Novel Method for Validating the Efficacy of Neurocytoprotectors // Neuroscience and Behavioral Physiology. – 2019. – V. 49(1). P.142-146. doi:10.1007/s11055-018-0707-0.
7. Geelyn J L Ng. Stroke biomarkers in clinical practice: A critical appraisal // Neurochemistry International. - 2017. – V. 107.Р.11-22.       doi:10.1016/j.neuint.2017.01.005.
8. Alpay Tuncar. Is there a relationship between NR-2 antibody peptide level and diagnosis, prognosis and coma scores in acute ischemic stroke? // Acta Medica Alanya. – 2022. – V. 6(2). P.145-150. doi: 10.30565/medalanya.1116544
9. Larisa A. Dobrynina. Anti-NR2 glutamate receptor antibodies as an early biomarker of cerebral small vessel disease // Clinical Biochemistry. -  2021. – V. 96. Р. 26–32. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2021.07.003
10. Jessica Paganoa. N-methyl-D-aspartate receptor function in neuronal and synaptic development and signaling // Current Opinion in Pharmacology. -  2021. – V.56.- Р. 93–101. doi.org/10.1016/j.coph.2020.12.006 
11. Mian Xie. Changes in NMDA Receptor Function in Rapid Ischemic Tolerance: A Potential Role for Tri-Heteromeric NMDA Receptors // Biomolecules. -  2022. - № 12. Р. 1214. doi.org/10.3390/biom12091214
12. Dambinova S. Functional, Structural, and Neurotoxicity Biomarkers in Integrative Assessment of Concussions // Frontiers of Neurology. – 2016. - № 7. Р. 12.  doi: 10.3389/fneur.2016.00172
13. Dambinova S. Glutamate Receptor Peptides as Potential Neurovascular Biomarkers of Acute Stroke // Stroke Biomarkers/ - 2020. – P. 195-224. doi 10.1007/978-1-4939-9682-7_11
14. Kobeissy F. Autoantibodies in CNS Trauma and Neuropsychiatric Disorders: A New Generation of Biomarkers // Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. -  2015. – Chapter 29
15. S.A. Dambinova. Diagnostic potential of the NMDA receptor peptide assay for acute ischemic stroke // PLoS ONE. 2012. №7. doi.org/10.1371/journal. pone.0042362.
16. K. Bettermann. Biomarkers for stroke: in search of fingerprints // Journal of Stroke Cerebrovascular disease: the official of National Stroke Association. – 2011. V.20. Р. 173–176. doi.org/10.1016/j. jstrokecerebrovasdis.2011.02.003
17. Alina González-Quevedo. Detecting asymptomatic cerebral small vessel disease. Brain specific proteins as surrogate biomarkers // In book: Understanding and Treating Cerebral Small Vessel Disease. – 2021. -  Chapter.10. - P. 231-266.
18. Карпова Е.Н. Эпидемиология и факторы риска развития ишемического инсульта // Современные проблемы науки и образования. - 2015. -  №4. С. 441.