ISOLATION OF BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUS TYPE TWO IN SENSITIVE CELL CULTURES

ISOLATION OF BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUS TYPE TWO IN SENSITIVE CELL CULTURES

Roman Bubyakin

Postgraduate, Federal Centre for Animal Health,

Russia, Vladimir, Yur’evets

Svetlana Kononova

PhD, Federal Centre for Animal Health,

Russia, Vladimir, Yur’evets

ПОЛУЧЕНИЕ ИЗОЛЯТА ВИРУСА ДИАРЕИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ВТОРОГО ГЕНОТИПА В ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ

Бубякин Роман Игоревич

аспирант, Федеральный центр охраны здоровья животных,

РФ, г. Владимир, Юрьевец

Кононова Светлана Владимировна

канд. биол. наук, Федеральный центр охраны здоровья животных,

РФ, г. Владимир, Юрьевец

Введение

Вирусная диарея КРС - болезнь характеризующаяся поражением желудочно-кишечного и респираторного трактов, сопровождающаяся нарушением функции воспроизводства.

Данное заболевание наносит значительный экономический ущерб молочному и мясному животноводству во всем мире и оказывает негативное влияние на производство животноводческой продукции.

В настоящее время на территории РФ выделяют как минимум 15 субтипов ВД КРС 1 (от 1a до 1о) и, по меньшей мере, пять субтипов ВД КРС 2 (от 2а до 2е). Оба типа возбудителя вызывают одинаковую патологию у животных, но штаммы второго типа более вирулентны и встречаются реже. Оба вируса представлены цитопатогенным (ЦП) и нецитопатогенным (НЦП) биотипами, причем преобладают НЦП [4].

Многими исследователями было установлено, что основными причинами проникновения ВД 2 генотипа в хозяйства (в т.ч. российских) являются контаминирование биотехнологических продуктов и импорт скота, завезенного из первично характеризующей вирус территории (к примеру США) [2].

За последние 15 лет уже регистрировали очаговые вспышки болезни, спровоцированной вирусом диареи КРС второго генотипа. Котеневой и соавт. возбудитель был выявлен во внутренних органах абортированного плода и мертворожденного теленка местной породы. Клиническая картина наблюдается по территории Уральского хребта и Западной Сибири. [1,3]

Выделение и идентификация вируса ВД КРС в культуре клеток остается «золотым стандартом» диагностики болезни в настоящее время. Вирус хорошо реплицируется в первичных и перевиваемых клеточных линиях нескольких видов животных. Для его выделения от больных животных используют цельную кровь, пробы носовых и влагалищных выделений, лимфоидные органы (селезенку, образцы лимфатических узлов, тимус). Однако размножение вируса ВД КРС в культуре клеток не всегда вызывает видимый цитопатический эффект, в 70–90% случаев его изоляты являются НЦП [5].

Угроза распространения заболевания по стране как через хозяйства, так и при коммерческой торговле скотом, требует проведения лабораторного надзора среди поголовья. При разработке средств профилактики и методов борьбы с ВД КРС необходимо учитывать генотиповую и субгенотиповую принадлежность циркулирующего возбудителя в стаде.

В связи с возможностью протекания инфекции в скрытой форме, а также высокими экономическими последствиями для хозяйств необходимо проводить контроль по распространению возбудителя ВД КРС и продолжать исследования по изучению вариабельности циркулирующих изолятов, а также их свойств.

Цель данного исследования: выделить вирус ВД КРС в клеточной культуре, определить спектр чувствительных клеточных систем.

Материалы и методы:

Выделение нукленовых кислот из образцов для последующего проведения ПЦР проводили при помощи коммерческого набора «РИБО-сорб» производства ИнтерЛабСервис. Реакция амплификации осуществлялась при применении набора производства ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора с использованием амплификатора «Rotor-Gene 6000».

Для выявления генома вируса ВД КРС использовали праймеры, амплифицирующие участок 5’-UTR. Секвенирование осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems), согласно инструкции изготовителя.

Для культивирование возбудителя диареи КРС использовали культуру клеток тестикул ягненка (ТЯ-1), в ростовой питательной среде ПСП с добавлением 10% фетальной сыворотки КРС. Из флаконов с выросшим монослоем удаляли ростовую питательную среду и вносили вирусную суспензию. После контакта вирусного материала с клетками вносили поддерживающую среду ПСП, не содержащую сыворотку. Вирус культивировали в течение пяти последовательных пассажей, ежедневно проводили наблюдение за развитием цитопатического эффекта вируса в монослое клеток.

Накопление вируса в культурах клеток определяли с помощью титрования стандартным способом в культуре клеток MDBK и рассчитывали по методу Рида и Менча. Титр выражали в lgТЦД₅₀/см³.

Результаты.

С целью выделения ВД КРС, на базе референтной лаборатории болезней КРС за период с 2019 по 2021 гг. методом ПЦР было исследовано 246 проб патологического материала, поступившего в лабораторию из 21 хозяйств 19 субъектов РФ (табл.1). Геном вируса ВД КРС был выявлен в 9 образцах, что составило 4% от общего числа исследуемых проб.

Таблица 1.

ПЦР- исследования проб патологического материала в 2019-2021гг

Для дальнейших исследований в работу был взят материал, полученный из Челябинской области, положительный в ПЦР. Выделение вируса проводили в культуре клеток ТЯ-1, вносили предварительно подготовленную вируссодержащую суспензию на монослой клеточной системы.

Рисунок 1. Монослой 2-х суточный незараженной

Рисунок 2. Клетки культуры ТЯ, после инфицирования вирусом ВД КРС через 36 часов

Рисунок 3. Клетки культуры ТЯ, после инфицирования вирусом ВД КРС через 72 часа

Первоначально в 1 и 2 пассажах не наблюдали видимых изменений в монослое клеток. В 3 пассаже отмечали отслаивание отдельных клеток с измененной морфологией от поверхности монослоя, как изображено на рисунках 1-3. Также ЦПД характеризовалось появлением округлившихся клеток, которые постепенно собирались в отдельные скопления.

По результату адаптации вируса (табл. 2), его титр в культуре клеток ТЯ-1 на пятом пассаже составлял 5,0 lgТЦД₅₀/см³.

Методом секвенирования установили, что выделенный изолят относится ко второму генотипу вируса.

Таблица 2.

Результаты адаптации изолята «Челябинск» к культуре клеток ТЯ-1

С целью определения спектра чувствительных культур клеток для культивирования изолята вируса диареи КРС были проведены исследования по оценке чувствительности таких клеточных систем как ТЯ-1, MDBK, ПС, ЯДК-04. Культивирование проводили в течение пяти последовательных пассажей, ориентируясь на степень проявления ЦПД вируса в монослое культур клеток. Результаты исследований представлены в табл. 3.

Таблица 3.

Инфекционная активность вируса ВД КРС в различных культурах клеток

Из данных, представленных в таблице 3 видно, что наибольшее накопление вируса было отмечено в культурах клеток ТЯ-1 и MDBK. Титр вируса к пятому пассажу составил 6,44±0,12 lgТЦД₅₀/см³в культуре клеток ТЯ-1 и 5,93±0,15 lgТЦД₅₀/см³в культуре клеток MDBK.

В культуре клеток ЯДК-04 также наблюдали прирост титров, но в меньших значениях. В ЯДК-04 титр вируса к пятому пассажу составил 5,35±0,15 lgТЦД₅₀/см³.

В культуре клеток ПС с 3 пассажа не фиксировалось ЦПД вируса. Методом ПЦР было подтверждено отсутствие генома вируса диареи КРС уже на уровне 4-5 пассажей. Изолят ВД КРС не продуцируется.

Таким образом культуры клеток ТЯ-1 и MDBK, в связи с наибольшим накоплением вируса за промежуток культивирования, были отобраны для наработки активного вирусного материала.

Выводы.

В результате проделанной работы был получен изолят вируса диареи КРС, относящийся ко второму генотипу. Изолят «Челябинск», был адаптирован в клеточной культуре тестикул ягненка ТЯ-1, титр инфекционной активности к пятому пассажу составлял 5,0 lgТЦД₅₀/см³. Также был определен спектр чувствительных клеточных систем (ТЯ-1, MDBK, ЯДК-04), для получения активного вирусного материала.

Список литературы:

1. Глотов А.Г., Котенева С.В., Глотова Т.И., Южаков А.Г., Максютов Р.А., Забережный А.Д. Филогенетический анализ пестивирусов крупного рогатого скота, Выявленных в Сибири. Вопросы Вирусологии. 2018; 63(4)
2. Глотов А.Г., «Выделение на территории Российской Федерации нецитопатогенного изолята 2го генотипа вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота» / А.Г.  Глотов, Т.И. Глотова, А.Г. Южаков, А.Д. Забережный, Т.И. Алипер// Вопросы вирусологии. – 2009. - №5. – С.43-47.
3. Котенева С.В., Нефедченко А.В., Глотов А. Г., Глотова Т. И. Генетический полиморфизм возбудителя вирусной диареи (болезни слизистых оболочек) крупного рогатого скота на молочных комплексах Сибири. Сельскохозяйственная биология. 2018; 53 (6): 1238–1246. DOI: 10.15389/agrobiology.2015.4.399rus.
4. Глотов А. Г., Глотова Т. И. Атипичные пестивирусы крупного рогатого скота (обзор). Сельскохозяйственная биология. 2015; 50 (4): 399–408. DOI: 10.15389/agrobiology.2015.4.399rus.
5. Мищенко В. А., Корпусова Т. И., Думова В. В., Пичуева А. А., Коропова Н. В., Кононов А. В. и др. Оптимизация условий культивирования вирусов КРС в перевиваемых культурах клеток. Ветеринария. 2014; 2: 60–63. eLIBRARY ID: 21299823.