ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ ИЗ НАИВНОГО В ПРАЙМИРОВАННОЕ СОСТОЯНИЕ СОПРОВОЖДАЕТСЯ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНОВ ИММУНОПРОТЕАСОМ

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ ИЗ НАИВНОГО В ПРАЙМИРОВАННОЕ СОСТОЯНИЕ СОПРОВОЖДАЕТСЯ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНОВ ИММУНОПРОТЕАСОМ

Цимоха Анна Сергеевна

канд. биол. наук, Институт цитологии РАН,

РФ, г. Санкт-Петербург

DIFFERENTIATION OF MOUSE EMBRYONIC STEM CELLS FROM A NAIVE TO A PRIMED STATE IS ACCOMPANIED BY THE EXPRESSION OF IMMUNOPROTEASOME GENE

Anna Tsimokha

Candidate of biological sciences, Institute of Cytology RAS,

Russia, Saint-Petersburg

АННОТАЦИЯ

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) обладают способностью противостоять повреждающим факторам, которые могли бы привести к выходу из состояния плюрипотентности и старению, и имеют повышенную устойчивость к повреждениям генома, пониженную частоту мутаций и продуцируют гораздо меньше радикалов кислорода по сравнению с дифференцированными клетками. Это свойство обеспечивается усиленной активностью защитных систем клетки, включая поддержание белкового гомеостаза (протеостаза), одним из ключевых участником которого является убиквитин-протеасомная система. Известно, что ЭСК мыши не экспрессируют гены иммунопротеасом, однако, уровень экспрессии этих генов увеличивается при дифференцировке ЭСК. Мы не обнаружили экспрессии генов иммунопротеасом ни в ЭСК мыши, ни в процессе их дифференцировки. Однако мы показали, что экспрессия генов иммунопротеасом происходит лишь при дифференцировке ЭСК в эпибластные стволовые клетки. Полученные нами данные подтверждают данные сравнения транскриптомов ЭСК мыши (наивных плюрипотентных клеток) и эпибластных стволовых клеток (праймированных плюрипотентных клеток), и свидетельствует об участии иммунопротеасом в поддержании стволовых клеток в состоянии праймированной плюрипотентности.

ABSTRACT

Embryonic stem cells (ESCs) have the ability to resist damaging factors that could lead to the exit from the state of pluripotency and aging, and have an increased resistance to genome damage, a reduced frequency of mutations, and produce much fewer oxygen radicals compared to differentiated cells. This property is provided by the enhanced activity of the cell defense systems, including the maintenance of protein homeostasis (proteostasis), one of the key participants in which is the ubiquitin-proteasome system. It is known that mouse ESCs do not express genes of immunoproteasomes; however, the level of expression of these genes increases during ESC differentiation. We did not find expression of immunoproteasome genes either in mouse ESCs or during their differentiation. However, we have shown that the expression of immunoproteasome genes occurs only during the differentiation of ESCs into epiblastic stem cells. Our data confirm the data comparing the transcriptomes of mouse ESCs (naive pluripotent cells) and epiblast stem cells (primed pluripotent cells), and indicate the participation of immunoproteasomes in maintaining stem cells in a state of primed pluripotency.

Ключевые слова: иммунопротеасома; плюрипотентные стволовые клетки; праймированная / наивная плюрипотентность; протеолиз; LMP.

Keywords: immunoproteasome; LMP; pluripotent stem cells; primed/naïve pluripotency; proteolysis.

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) – это плюрипотентные клетки, обладающие способностью дифференцироваться во все типы соматических клеток. ЭСК выделяют на этапе предимплантационной бластоцисты из внутренней клеточной массы [1]. Благодаря свойству самообновления ЭСК, при соблюдении определённых условий такие клетки можно культивировать неограниченное время in vitro.

Известно, что ЭСК обладают способностью противостоять повреждающим факторам, которые могли бы привести к выходу из состояния плюрипотентности и старению [2]. Так, показано, что ЭСК имеют повышенную устойчивость к повреждениям генома, пониженную частоту мутаций, и продуцируют гораздо меньше радикалов кислорода по сравнению с дифференцированными клетками [3]. Это свойство ЭСК обеспечивается усиленной активностью защитных систем клетки.

Очевидно, что поддержание белкового гомеостаза является важным для внутриклеточного метаболизма. Убиквитин-протеасомная система (УПС) деградации белков осуществляет большую часть регулируемого протеолиза в клетке и является одним из ключевых регуляторов многих клеточных процессов. При определенных условиях конститутивные каталитические субъединицы протеасомы могут замещаться на индуцибельные. В такой конфигурации протеасома называется иммунопротеасомой (ИП) и принимает участие в иммунном ответе в процессе презентации антигена в составе молекулы MHC-I [4]. За последние годы появилось множество исследований, предполагающих важную роль ИП в поддержании и индукции плюрипотентности, а также в процессе клеточной дифференцировки [5-7].

В настоящее время выделяют три устойчивых состояния ЭСК по мере приближения дифференцировки: раннее (наивные ЭСК), промежуточное и позднее (праймированные ЭСК). Согласно данным РНК-секвенирования, переход ЭСК мыши из состояния наивной плюрипотентности в праймированное как раз сопровождается повышенной экспрессией иммунных субъединиц протеасом [8]. Однако роль ИП в этом процессе до сих пор остается неизученной.

Согласно транскриптомным данным дифференцировка наивных ЭСК в ЭпиСК сопровождается экспрессией иммуносубъединиц протеасом [9]. На рис. 1 представлена диаграмма, построенная на основе анализа транскриптомных данных, находящихся в свободном доступе (NCBI Database), и демонстрирующая усиление экспрессии иммуносубъединиц протеасом в ЭпиСК по сравнению с наивными ЭСК.

Рисунок 1. Уровень экспрессии гена PSMB8 (ES – embryonic stem cell – ЭСК в состоянии наивной плюрипотентности, EpiSC – Epiblast-derived stem cell – эпибластные стволовые клетки – ЭСК в состоянии праймированной плюрипотентности, EpiLC – Epi-like cells – формативные ПСК) [8]

Чтобы подтвердить эти данные для нашей линии ЭСК мыши и в наших условиях культивирования клеток мы использовали оптимизированный нами на первом этапе работы протокол дифференцировки ЭСК мыши в праймированное состояние. После чего ЭСК мыши линии Е14 в состояниях наивной и праймированной плюрипотентности анализировали на предмет наличия иммуносубъединиц протеасом с помощью вестерн-блот анализа клеточных лизатов. В качестве положительного контроля использовали соматические клетки – мышиные эмбриональные фибробласты (МЭФ), в которых экспрессия иммуносубъединиц протеасом была индуцирована с помощью 150 ед. акт. гамма-интерферона в течение 24 ч (МЭФ INF+). Мы наблюдали драматическое снижение уровня NANOG в ЭпиПК на 2 сутки, что подтверждает праймированное состояние ЭСК мыши в нашем эксперименте, при этом ЭпиПК сохраняют экспрессию Oct4, и начинают экспрессировать субъединицу ИП LMP7, тогда как в наивных ЭСК этот белок ИП не синтезируется (рис. 2). Интересно, что наблюдается некоторое снижение синтеза LMP7 на 5 сутки поддержания ЭпиПК в культуре и уровень его снова увеличивается на 10 сутки.

Рисунок 2. Вестерн-блот анализ ЭСК мыши линии Е14 в состояниях наивной и праймированной плюрипотентности (культивирование в течение 2, 5 и 10 суток) с использованием антител к маркерам плюрипотентности и белкам протеасом. Количество белка в образцах нормализовали по актину

Интересно, что мы не наблюдали экспрессию иммунопротеасом ни в ЭСК мыши, ни в процессе их дифференцировки с помощью ретиноевой кислоты (данные не представлены). Это противоречило литературным данным [10], что привело нас к необходимости биоинформатического анализа имеющихся в открытом доступе транскриптомов ЭСК мыши на разных этапах дифференцировки. Сравнение транскриптомов наивных ЭСК и ЭпиСК мыши [8] показало повышенную экспрессию субъединиц иммунопротеасом в ЭСК в праймированном состоянии. Таким образом можно заключить, что экспрессия ИП сопровождает не ранние этапы дифференцировки ЭСК in vitro, а переход ЭСК в праймированное состояние или, другими словами, дифференцирование ЭСК мыши в состояние ЭпиСК.

Список литературы:

1. Thomson J. A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S. S., Waknitz M. A., Swiergiel J. J., Marshall V. S., Jones J. M. J. s. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts//. – 1998. – Vol. 282. – N. 539 – P. 1145-1147.
2. Young R. A. J. C. Control of the embryonic stem cell state//. – 2011. – Vol. 144. – N. 6. – P. 940-954.
3. Vilchez D., Simic M. S., Dillin A. J. T. i. c. b. Proteostasis and aging of stem cells//. – 2014. – Vol. 24. – N. – P. 161-170.
4. Strehl B., Seifert U., Krüger E., Heink S., Kuckelkorn U., Kloetzel P. M. J. I. r. Interferon‐γ, the functional plasticity of the ubiquitin–proteasome system, and MHC class I antigen processing//. – 2005. – Vol. 207. – N. 1. – P. 19-30.
5. Vilchez D., Boyer L., Morantte I., Lutz M., Merkwirth C., Joyce D., Spencer B., Page L., Masliah E., Berggren W. T., Gage F. H., Dillin A. Increased proteasome activity in human embryonic stem cells is regulated by PSMD11// Nature. – 2012. – Vol. 489. – N. 741 – P. 304-308.
6. Buckley S. M., Aranda-Orgilles B., Strikoudis A., Apostolou E., Loizou E., Moran-Crusio K., Farnsworth C. L., Koller A. A., Dasgupta R., Silva J. C., Stadtfeld M., Hochedlinger K., Chen E. I., et al. Regulation of pluripotency and cellular reprogramming by the ubiquitin-proteasome system// Cell stem cell. – 2012. – Vol. 11. – N. – P. 783-798.
7. Atkinson S. P., Collin J., Irina N., Anyfantis G., Kyung B. K., Lako M., Armstrong L. A putative role for the immunoproteasome in the maintenance of pluripotency in human embryonic stem cells// Stem Cells. – 2012. – Vol. 30. – N. – P. 1373-1384.
8. Hayashi K., Ohta H., Kurimoto K., Aramaki S., Saitou M. J. C. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells//. – 2011. – Vol. 146. – N. 4. – P. 519-532.
9. Sato N., Sanjuan I. M., Heke M., Uchida M., Naef F., Brivanlou A. H. J. D. b. Molecular signature of human embryonic stem cells and its comparison with the mouse//. – 2003. – Vol. 260. – N. 2. – P. 404-413.
10. Hernebring M., Fredriksson A., Liljevald M., Cvijovic M., Norrman K., Wiseman J., Semb H., Nystrom T. Removal of damaged proteins during ES cell fate specification requires the proteasome activator PA28// Sci Rep. – 2013. – Vol. 3. – N. – P. 1381.