СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ ПОЛОКСАМЕРОВ ПРИ ВНУТРИВЕННОМ ВВЕДЕНИИ НА АУТБРЕДНЫХ КРЫСАХ.

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ ПОЛОКСАМЕРОВ ПРИ ВНУТРИВЕННОМ ВВЕДЕНИИ НА АУТБРЕДНЫХ КРЫСАХ

Аршинцева Елена Валентиновна

технолог ООО «Эмульсии медицинские»,

РФ, Московская область, г. Серпухов

Пушкин Сергей Юрьевич

директор ООО «Эмульсии медицинские»,

РФ, Московская область, г. Серпухов

COMPARATIVE STUDY OF ACUTE TOXICITY OF POLOXAMERS WITH INTRAVENOUS ADMINISTRATION IN OUTBRED RATS

Elena Arshintseva

"Medical emulsions", LLC,

Russia, Moscow region, Serpukhov

Sergei Pushkin

"Medical emulsions", LLC,

Russia, Moscow region, Serpukhov

АННОТАЦИЯ

Важнейшей задачей при производстве лекарственных средств является обеспечение их безопасности. В частности, при смене производителя активной фармацевтической субстанции, производитель лекарственного средства должен быть абсолютно уверен в идентичности и безопасности субстанции от нового производителя. Проведено исследование острой токсичности активных фармацевтических субстанций полоксамеров «Эмуксол 268» и Kolliphor 188 на аутбредных крысах в дозах 800 и 1330 мг/кг при однократном внутривенном введении. Установлено, что однократное введение испытуемых доз Kolliphor 188 и Эмуксол 268 не вызывало интоксикации и гибели экспериментальных животных. Значения ЛД₅₀ для Kolliphor 188 и Эмуксол 268 при внутривенном введении для крыс превышают максимальную испытанную дозу - 1330 мг/кг. Оба вещества не обладают местным раздражающим действием при однократном применении.

Abstract

The most important task in the production of medicines is to ensure their safety. In particular, when changing the manufacturer of an active pharmaceutical substance, the manufacturer of the medicinal product must be absolutely sure of the identity and safety of the substance from the new manufacturer. Acute toxicity of active pharmaceutical substances of poloxamers "Emuxol 268" and Kolliphor 188 was studied in outbred rats at doses of 800 and 1330 mg/kg with a single intravenous injection. It was found that a single administration of the tested doses of Kolliphor 188 and Emuxol 268 did not cause intoxication and death of experimental animals. LD50 values for Kolliphor 188 and Emuxol 268 when administered intravenously to rats exceed the maximum tested dose of 1330 mg/kg. Both substances do not have a local irritant effect with a single application.

Ключевые слова: полоксамер, перфторан, перфторорганические эмульсии, острая токсичность, кровезаменитель.

Keywords: poloxamer, perftoran, perfluoroorganic emulsions, acute toxicity, blood substitute.

1. Введение.

Одной из задач, которая была решена при создании кровезаменителя на основе перфторорганической (ПФО) эмульсии Перфторан, был выбор поверхностно-активного вещества (ПАВ), который должен был обеспечить получение эмульсии с необходимым размером (менее 150 нм) и приемлемым сроком хранения (до двух лет) [1].

Наиболее подходящими под эти условия ПАВами оказались «неионогенные блоксополимеры окисей этилена и пропилена – «проксанолы» в СССР и «плюроники» за рубежом». [2]. В настоящее время, эти неионогенные ПАВы составляют обширную группу полоксамеров, и широко используются в промышленности, фармацевтической и косметической индустрии в качестве вспомогательных веществ. В фармакопеях США и Евросоюза присутствуют специальные статьи об этих веществах [3, 4].

Химическая формула полоксамера согласно USP/NF31 выглядит следующим образом HO(C₂H₄O)_a(C₃H₆O)_b(C₂H₄O)_aH, где a – полиоксиэтиленовые (ПОЭ) блоки, b – полиоксипропиленовые (ПОПР) блоки. Типы полоксамеров с указанием содержания ПОЭ и ПОПР блоков, а также их молекулярной массы (ММ) приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Типы и характеристики полоксамеров согласно европейской фармакопеи 5.0 статья 01/2005:1464

Также стоит отметить, что в трехзначном номере полоксамера закодированы ММ ПОПР блока, первые две из трех цифр номера полоксамера умноженные на 100, и процентное содержание ПОЭ блока, умноженная на 10 последняя цифра [5]. Такая кодировка позволяет приблизительно рассчитать ММ полоксамера.

Наиболее часто упоминались и продолжают упоминаться в научных статьях по ПФО-эмульсиям полоксамеры торговых марок «Эмуксол 268» (прежнее название Проксанол 268) и Kolliphor 188 (его другие названия Pluronic F68, Lutrol F68) [6, 7, 8, 9]. Многие исследователи называют эти полоксамеры аналогами или близкими по своим свойствам вещества [10, 11, 12]. Помимо разработчиков «Перфторана» и другие исследователи использовали для разработки кровезаменителей на основе ПФО-соединений полоксамер 188, например Fluosol DA [13]. Лекарственные средства на основе водных растворов полоксамера 188 были допущены FDA к клиническим исследованиям некоторых патологий, например, Мышечной дистрофии Дюшена [14] и серповидноклеточной анемии [15]. К сожалению, по результатам 3 фазы клинических исследований использование водного раствора полоксамера 188 в дозах терапии серповидноклеточной анемии был сделан вывод, что для предложенная технология лечения не эффективна [16]. Авторы терапии предлагали делать внутривенную инфузию очищенного полоксамера 188 в дозах 100 мг/кг/1 час, затем 30 мг/кг/в час в течение 47 часов.

Интересно, что для плюроников с их двух или трехзначными номерами, например Pluronic F68 или Pluronic F127, для расчета приблизительной ММ используется несколько другая формула. Последняя цифра, умноженная на 10, обозначает содержание ПОЭ в процентах, а первые одна или две цифры, умноженные на 300, соответствуют ММ ПОПР [17].

В таблице 2 сведены данные из сертификатов анализа на полоксамеры Эмуксол 268 (НИОПИК) [18] и Kolliphor 188 (BASF) [19].

Таблица 2.

Физико-химические свойства Эмуксола 268 и Kolliphor 188.

Из таблицы 2 видно, что полоксамер под торговой маркой Kolliphor 188 является полоксамером 188, а полоксамер «Эмуксол 268» по ММ и некоторым другим показателям (цветность раствора, внешний вид и pH) сильно отличается от Kolliphor 188, и не является полоксамером 188.

При производстве лекарственных средств допустимо менять производителя АФС, но в этом случае лекарственное средство должно пройти соответствующий государственный контроль. [20].

На этапе разработки лекарственного средства, при подборе ПАВ и ПФО-соединений создатели Перфторана для ускорения и удешевления работы использовали клеточный тест с культивированием лимфоидных человеческих клеток [21]. Но при замене АФС, например замена полоксамера «Эмуксол 268» на Kolliphor 188, в действующим лекарственном средстве клеточного теста будет недостаточно, и для полной уверенности необходимо провести исследования на животных, которые полностью подтвердят безопасность и эффективность данной АФС. Проведение таких исследований тем более необходимо из-за того, что паспортные данные на «Эмуксол 268» и Kolliphor 188 значительно отличаются.

К исследованиям на безопасность относятся следующие исследования: максимальная токсическая доза, острая токсичность (токсичность после однократного введения), хроническая токсичность (токсичность после многократного введения), токсико кинетика, генотоксичность и другие.

Цель настоящей работы - сравнительное доклиническое изучение острой токсичности Kolliphor 188 и Эмуксол 268 при внутривенном введении на аутбредных крысах.

Данное исследование острой токсичности Kolliphor 188 и Эмуксол 268 при однократном введении регламентируется требованиями нормативных документов Минздравсоцразвития России.

В задачи исследования входило изучение уровня и характера возможного повреждающего действия на организм лабораторных животных полоксамеров Kolliphor 188 и Проксанол 268 при однократном внутривенном введении в различных дозах.

Работа выполнена в соответствии с «Методическими указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ» [22] в ФГУН НИЦ Токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов ФМБА России.

Схема данного исследования, контрольное вещество, испытуемые дозы и способ введения определены авторами статьи.

2. Материалы и методы.

Опыты проводили на белых аутбредных крысах обоего пола массой тела 150–200 г и возрастом к началу введения 10–12 недель, количество самцов/самок (30:30).

Поставщик животных питомник лабораторных животных Филиал «Андреевка» ФГБУН "НЦБМТ" ФМБА России.

Животные содержались в контролируемых условиях окружающей среды (температура 18-22⁰C, относительная влажность 50-65%, 12 часовой цикл освещения и кратность воздухообмена 10 смен объема воздуха комнаты в час).

Кормили животных экструдированным комбикормом ПК-120-1, приготовленным по ГОСТ Р 50258-92, а также животные имели свободный доступ к питьевой воде. Животные прошли карантин и акклиматизацию в условиях вивария при групповом содержании в клетках в течение не менее 14 дней. Во время этого периода у животных каждый день контролировалось клиническое состояние путем визуального осмотра. В течение всего исследования оценка общего состояния животных проводилась один раз в сутки в первой половине дня, подробный клинический осмотр и взвешивание каждого животного проводились еженедельно, контролировалось потребление корма и воды животными в отдельных клетках.

Экспериментальные группы животных формировали методом случайной выборки с учетом массы тела в качестве ведущего показателя. Животные, оставшиеся после формирования экспериментальных групп, были оставлены в качестве сигнальной группы для оценки окружающей среды.

Объектами исследования явились тестируемые вещества: водный 13,3 % раствор полоксамера 188 (Kolliphor 188, BASF, Германия) c 0,9 % NaCl; водный 13,3 % раствор полоксамера (Эмуксол 268, НИОПИК, Россия), в качестве носителя использовался раствор для инфузий 0,9 % NaCl (ОАО «КРАСФАРМА», Россия).

Растворы веществ в 0,9%-ном растворе хлорида натрия готовили перед введением животным в асептических условиях ех tempora, фасовали в соответствующие промаркированные флаконы и до введения хранили при температуре +2° - +6°С не более 2 часов.

Тестируемые вещества (растворы Kolliphor 188 и Эмуксол 268) и носитель (раствор 0,9% NaCl) вводили внутривенно однократно экспериментальным и контрольным группам животных соответственно в соответствии со схемой, представленной в таблице 3. Вводимые дозы корректировали с учетом индивидуальной массы тела животного.

В период наблюдения в каждой группе животных оценивали общее состояние крыс по их двигательной активности, потреблению корма и воды, состоянию шерсти и слизистых оболочек, массе тела.

Таблица 3.

Схема эксперимента

m – самцы, f – самки.

Некропсия животных была проведена согласно схеме эксперимента в плановом порядке на 15 сутки — у всех животных, получивших носитель и максимальные дозы тестируемых веществ.

Для всех количественных данных была применена описательная статистика: подсчитаны средние значения и стандартное отклонение (М±SD), которые представлены в итоговых таблицах. Исключение «выскакивающих» значений проводили Q-тестом. Статистический анализ данных проводился с помощью программного пакета STATISTICA 6. Сравнение с контролем проводили по критерию Ньюмана-Кейсли. Анализ выполнен для каждого пола отдельно.

3. Результаты исследований.

3.1. Результаты клинического наблюдения.

Острую токсичность тестируемых веществ Kolliphor 188 и Эмуксол 268 изучали на белых аутбредных крысах, которым однократно внутривенно вводили растворы в дозах 800 и 1330 мг/кг.

Контрольным животным вводили носитель - 0,9%-ный стерильный раствор NаС1 в таком же в объеме, как и растворы изучаемых веществ.

После введения и в течение периода наблюдения симптомов острой интоксикации и гибели животных не было, общее состояние животных экспериментальных и контрольных групп не различалось, животные равномерно прибавляли в весе во всех группах (табл. 4 и 5).

Таблица 4.

Масса тела самцов

Таблица 5.

Масса тела самок

3.2. Результаты патологического исследования

При патологоанатомическом вскрытии после окончания периода наблюдения при внешнем осмотре и исследовании не было установлено различий между крысами экспериментальных и контрольных групп: шерстный покров был гладкий, блестящий, кожа эластичная, подвижная, подкожная клетчатка умеренно выражена, видимые слизистые оболочки бледные, чистые, без изъязвлений и посторонних наложений, патологические выделения из естественных отверстий тела отсутствовали. В месте внутривенного введения на хвостах животных во всех группах признаки воспаления отсутствовали, отека и уплотнения тканей не обнаружено.

При вскрытии грудной и брюшной полостей отмечалось анатомически правильное расположение внутренних органов. Макроскопически различимых признаков патологии внутренних органов не установлено.

4. Выводы.

На белых аутбредных крысах изучена острая токсичность Kolliphor 188 и Эмуксол 268 при однократном внутривенном введении в дозах 800 и 1330 мг/кг. Контрольным животным вводили растворитель - 0,9%-ный стерильный раствор хлорида натрия в таком же в объеме, как и растворы изучаемых веществ.

По результатам клинических наблюдений за общим состоянием животных и патоморфологических исследований после однократного введения лутрола и проксанола в дозах 800 и 1330 мг/кг/день и 14 дней наблюдения неблагоприятных изменений, вызванных действием обоих веществ, не выявлено.

Установлено, что однократное введение испытуемых доз Kolliphor 188 и Эмуксол 268 не вызывало интоксикации и гибели экспериментальных животных. Значения ЛД₅₀ для Kolliphor 188 и Эмуксол 268 при внутривенном введении для крыс превышают максимальную испытанную дозу - 1330 мг/кг. Оба вещества не обладают местным раздражающим действием при однократном применении.

5. Заключение.

На основании полученных данных можно утверждать, что в рамках проведенных исследований Kolliphor 188 (ВАSF, Германия) по токсическим свойствам практически не отличается от Эмуксола 268 (ФГУП «ГНЦ НИОПИК», Россия).

При положительном завершении других токсикологических исследований, например, хронической токсичности, можно будет принять решение, что замена АФС в ПФО-эмульсиях, содержащая полоксамер «Эмуксол 268» на АФС, содержащая полоксамер 188 Kolliphor 188 не ухудшит безопасность лекарственных средств на основе ПФО-эмульсии.

Благодарность.

Авторы выражают искреннюю благодарность сотрудникам в ФГУН НИЦ Токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов ФМБА России к.б.н. Онацкому Н.М., к.б.н. Рыбалкину С.П., к.б.н. Блохину В.А. за предоставленные данные по животным.

Список литературы:

1. Щукин Е.Д., Маркина З.Н., Цикурина Н.Н., Задымова Н.М., Бовкун О.П., Макаров К.Н., Гервиц Л.Л., Кнунянц И.Л. Об эмульгирующей способности низкомолекулярных ПАВ по отношению к перфторуглеродам в водной среде. // Фторуглеродные газопереносящие среды. Сборник научных трудов по редакцией проф. Белоярцева Ф.Ф. – Пущино, 1984, с. 63-70.
2. Кирш Ю.Э., Панов В.П., Гельфер Ц.М., Овсянникова С.В., Долотова Т.А., Смирнов М.Б., Быстрицкий Г.И. Изучение состава, молекулярной массы и молекулярно-массового распределения блок-сополимеров окисей этилена и пропилена. // Фторуглеродные газопереносящие среды. Сборник научных трудов по редакцией проф. Белоярцева Ф.Ф. – Пущино, 1984, с. 70-73.
3. Poloxamer USP/NF.
4. Poloxamer Ph. Eur.
5. Будкина О.А. Структурно-функциональные закономерности воздействия амфифильных блок-сополимеров на раковые клетки. // Дисс. на соискание уч степени к.х.н. Москва, 2015.
6. Маевский Е.И., Иваницкий Г.Р., Макаров К.Н., Гервиц Л.Л., Мороз В.В. Эмульсия перфторорганических соединений медицинского назначения, способ ее приготовления и способ ее применения. Патент на изобретение RU 2393849, приоритет от 28.12.2006.
7. Фейзулова Р.Г., Хромов А.В. и др. Эмульсия перфторорганических соединений с газотранспортными свойствами. Патент на изобретение RU 2469714, приоритет от 15.07.2011.
8. Пушкин С.Ю. Способ приготовления стерильной наноэмульсии перфторорганических соединений. Патент на изобретение RU 2557933, приоритет от 27.03.2014.
9. Аршинцева Е.В., Пушкин С.Ю. Термический способ стерилизации жидких лекарственных средств, содержащих в своем составе полоксамер. Патент на изобретение RU 2741710, приоритет от 12.07.2018.
10. Maevsky E., Ivanitsky G. (2005) Oxygen-Dependent and Oxygen-Independent Effects of Perftoran. In: Kobayashi K., Tsuchida E., Horinouchi H. (eds) Artificial Oxygen Carrier. Keio University International Symposia for Life Sciences and Medicine, vol 12. Springer, Tokyo.
11. Склифас А.Н., Шехтман Д.Г. и др. Сорбция компонентов плазмы крови на поверхности частиц фторуглеродных эмульсий, стабилизированных проксанолом 268 // Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в экспериментальной и клинической медицине. Тезисы Всероссийская научная конференция 19-20 июня 2001 года под общей редакцией академика РАМН профессора Г.А.Софронова, с. 69.
12. Кузнецова И.Н. Биодоступность и биоэквивалентность эмульсий перфторуглеродов разного состава в комплексной терапии критических состояний // Общая реаниматология, 2007, III; 3/1, с. 17-24.
13. Mitsuno T., Ohyanagi H. Present status of clinical studies of Fluosol-DA (20%) in Japan // Int Anesthesiol Clin. Spring 1985; 23(1):169-84.
14. Joseph G. Moloughney, Noah Weisleder. Poloxamer 188 (P188) as a Membrane Resealing Reagent in Biomedical Applications // Recent Pat Biotechnol. 2012 Dec; 6(3): 200–211.
15. Eugene P. Orringer; James F. Casella; Kenneth I. Ataga; et al. Purified Poloxamer 188 for Treatment of Acute Vaso-occlusive Crisis of Sickle Cell DiseaseA Randomized Controlled Trial. JAMA. 2001;286(17):2099-2106. doi:10.1001/jama.286.17.2099
16. James F. Casella; Bruce A. Barton; Julie Kanter; et al. Effect of Poloxamer 188 vs Placebo on Painful Vaso-Occlusive Episodes in Children and Adults With Sickle Cell Disease. A Randomized Clinical Trial. JAMA. 2021;325(15):1513-1523. doi:10.1001/jama.2021.3414
17. Martin Emanuele and Balu Balasubramaniam. Differential Effects of Commercial-Grade and Purified Poloxamer 188 on Renal Function. Drugs R D. 2014 Jun; 14(2): 73–83.
18. Сайт ФГУП ГНЦ «НИОПИК»: niopik.ru.
19. Сайт химического концерна БАСФ: Pharma.basf.com.
20. «О предварительном государственном контроле лекарственных средств». Письмо Росздравнадзора № 01И-539/07 от 24.07.2007.
21. Илларионов Э.Ф., Маевский Е.И. и др. Физико-химическая и биологическая оценка свойств проксанолов – стабилизаторов перфторорганических соединений. // Фторуглеродные газопереносящие среды. Сборник научных трудов по редакцией проф. Белоярцева Ф.Ф. – Пущино, 1984, с. 73-78
22. «Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ». // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. проф. Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО "Издательство "Медицина", 2005. - С.41-54